A sensitive immuno-detection strategy based on antigen-antibody interaction is going to be developed by means of immobilization of glucose oxidase (GOx) in nanoporous silica (MCF). An immuno-probe MCF-GOx-Ab was created, through immobilization of GOx within the large cellular pores of amine group modified MCF silica followed treatment with 0.5% GA, and covalently attaching goat anti-human IgG antibodies to the MCF-GOx. To facilitate the capturing of human IgG, three dimensional detection methods is used. Magnetic beads functionalized with epoxy group homogeneously were modified by goat anti-human IgG antibodies, and let it capturing of human IgG on the surface of beads. Finally the antigens were captured by the immuno-probe, MCF-GOx-Ab, and the signal was detected using Amplex Red, +D-glucose, and HRP as substrates followed measuring the absorbance at 570nm. From the immunoassay, MCG-Gox-goat anti-human IgG could sensitively detect human IgG captured by magnetic bead-Ab at the range of 10ng/mL (100pM) to 10ug/mL (100nM) within 10min short time of color developmental reaction, which showed about 20 times of higher signal compared to the goat anti-human IgG-GOx conjugate antibodies conjugated by ourselves. As a result, owing to the large loading percentage (∼14% (w/w)) of GOx, the immuno-probe using GOx immobilized in nanoporous MCF silica enabled it amplify the detection signal within pretty much short time, hence, gave better sensitivity. By taking advantage of the unique pore structures of MCF silica, in combination with cross-linking agent, enzymes were immobilized successfully and retained stably within pores, using which, a sensitive immuno-probe is created. This strategy has the potential for a broad biological application in enzyme immunoassay not just limited on magnetic based detection, but can be applid to ELISA, or some other immuno-detection. Enzymes like HRP or ALP or ALP also can be immobilized within the MCF silica using the same method, and the antigen detection sensitivity is presumed to be higher than their conjugate with antibodies.
글루코스 산화 효소 (glucose oxidase, GOx) 를 고정화한 나노다공성 MCF 실리카와 자기 구슬을 이용하여 샌드위치 방법의 면역진단 시스템을 개발하였다. 넓은 표면적, 및 기공 부피, 큰 직경과 균일한 크기의 메조기공(mesopores)과 같은 나노다공성 MCF 실리카의 독특한 구조적 특징을 활용하여 글루코스 산화 효소와 같이 큰 효소를 가교결합제 (cross-linking agent) 의 처리를 통해 효과적으로 고정화할 수 있었고, 실리카 기공내에서 안정적으로 유지하는 것이 가능하였다. 실리카의 표면은 아민기로 표면 처리가 되여 있어 효소가 고정화된 실리카의 표면에 항체를 공유결합 (MCF-GOx-Ab) 시킬 수 있었다. 결과적으로 MCF-GOx-Ab 진단 침은 항체가 표면에 붙여 있는 자기 구슬 (Mag-bead-Ab)과 함께 샌드위치의 방법으로 항원을 진단하는데 사용할 수 있었다. 자기 구슬 농도가 $10^7$ bead/mL 이고 반응 시간을 10min으로 한 기존의 최적화의 조건하에서 모델 항원으로서 사용한 인체 항원 (human IgG)을 100 pM 에서 100nM의 수준에서 감지할 수 있었다. 닭 항원 (chicken IgG)을 대조 항원으로 사용했을 때 거의 감지를 하지 않는 것으로 보아 MCF-GOx-Ab 와 Mag-bead-Ab 를 이용한 진단 방법은 특정 항원에 대해 좋은 특이성을 가진다는 것을 알 수 있었다. 그리고 기존의 일반적인 효소 면역 진단 방법에 사용해온 Ab-GOx을 똑같은 방법으로 Mag-bead-Ab와 함께 항원을 진단 했을 때 보다 약 20 배 가까이 신호가 증폭 되였음을 알 수 있었다. MCF 실리카와 자기 구슬을 이용해서 만든 면역 센서의 항원에 대한 감지 도를 높이기 위해 몇 가지 조건을 최적화 시켜야 할 것이다. 특히 자기 구슬의 농도는 낮추고, 실리카에 고정화되는 효소의 양을 늘리는 쪽으로 시도를 해야 하고, 표면에 붙은 항체의 개수와 촉매반응에 사용되는 기질의 양을 최적화하도록 조절해야 할 것이다. 그 외에도 다른 효소, 즉 면역 진단에 많이 쓰이는 HRP (horseradish peroxidase), 혹은 ALP(alkaline phosphatase)를 MCF 실리카에 고정화 해서 감지 도를 높이는 시도로 해볼 것이다., 효소를 MCF 실리카에 고정화하여 자기 구슬과 함께 샌드위치의 방법으로 면역진단을 하는 이 방법은 항원에 대한 감지 신호를 높임으로써 낮은 농도 수준의 항원까지도 감지 할 수 있는 잠재력을 가지고 있어, 앞으로 의학 질병진단, 환경 등 여러 가지 분야에 큰 기여가 되는 연구가 될 것이라 기대한다.
