The Ras/extracellular signal-regulated kinase (ERK) and the NF-kB signaling pathways are critically involved in diverse biological processes, including mitogenesis, cellular differentiation, and immune reactions. 1) Using gain-of-function and null mutants of RSK, its physiological role was characterized in Drosophila. Surprisingly, RSK-null mutants were viable, but exhibited developmental abnormalities related to an enhanced ERK-dependent cellular differentiation such as ectopic photoreceptor- and vein-cell formation. Conversely, overexpression of RSK dramatically suppressed the ERK-dependent differentiation, which was further augmented by mutations in the Ras/ERK pathway. Consistent with these physiological phenotypes, RSK negatively regulated ERK-mediated developmental processes and gene expressions by blocking the nuclear localization of ERK in a kinase activity-independent manner. Moreover, I further demonstrated that the RSK-dependent inhibition of ERK nuclear migration is mediated by the physical association between ERK and RSK. 2) Mitogen-activated protein kinase (MAPK) phosphatase 3 (MKP-3) is a well-known negative regulator in the Ras/ERK signaling pathway. Here, I demonstrated the physiological function of endogenous MKP-3 through the loss-of-function and null mutant-based studies. Although the DMKP-3 hypomorphic mutants well survived into adults with extra photoreceptor- and vein-cells, DMKP-3 null mutants showed embryonic lethality and severe oogenesis defects, demonstrating that MKP-3 is essential for the normal development in Drosophila. All of these phenotypes were highly similar to those of the gain-of-function mutants of ERK, and the functional interaction between MKP-3 and the Ras/ERK pathway was further confirmed by genetic interaction assays. 3) To find novel suppressors of the NF-kB signaling pathway, I performed a genetic screening for Drosophila mutants with hyper-activated immune responses, and isolated a loss-of-function mutant of caspar whose product is homologous to Fas-associated factor in mammals. Interestingly, caspar mutant flies showed increased anti-bacterial immune responses including dramatically increased resistance to bacterial infection and a constitutive expression of diptericin, a representative antibacterial peptide gene. Conversely, ectopic expression of caspar strongly suppressed infection-dependent gene expression of diptericin, which allowed bacterial outgrowth in the body of the infected flies. Consistent with these physiological phenotypes, Caspar negatively regulated the Imd-mediated immune responses by blocking nuclear translocation of Relish, an NF-kB transcription factor. In addition, I further demonstrated that DREDD-dependent cleavage of Relish, a prerequisite event for the nuclear entry of Relish, is the target of the Caspar-mediated suppression of the Imd pathway. Collectively, these studies reveal novel inhibitory mechanisms of the Ras/ERK pathway and the NF-kB pathway by RSK and MKP-3, and Caspar, respectively.
세포는 복잡하고 정교한 신호전달계를 통해서 생명현상을 일으키며 개체발생을 유도한다. 이러한 신호전달계중 Ras/MAPK-ERK신호전달계는 세포의 분화, 분열, 세포증식등 다양한 생물학적 반응을 일으키는 중요한 신호전달계로 알려져 왔다. Ras/ERK 신호전달계의 활성화 기작과 신호전달흐름을 전달하는 각각의 유전자들의 생리학적 기능이 자세히 알려져 왔지만, 이들 유전자의 일부는 포유류 계통의 유전체 내의 복잡성 때문에 기능에 대한 유전학적 연구가 이루어지지 못하였다. 특히 활성화된 Ras/ERK 신호전달계를 억제하는 유전자들의 기능은 생리학적인 연구가 전혀 진행되지 못했다. 따라서 본 연구자는 포유류보다 상대적으로 단순한 유전체를 가지고 있는 초파리를 이용하여 생체내에 존재하는 Ras/ERK 신호전달계의 조절기작을 심도있게 연구하였다. 처음으로, Ras/ERK 신호전달계의 최종 말단부분에 위치한 effector이며 다양한 기질을 활성화시킴으로써 Ras/ERK 신호전달계 의존적인 다양한 생물학적 반응을 유도하는 중요한 유전자인 RSK의 유전자기능을 유전학적, 생화학적, 조직학적 방법을 사용하여 조사하였다. 본 연구를 통하여 새로이 제작된 RSK 유전자가 완벽하게 결실된 초파리는 ERK 의존적인 세포분화가 증가된 발생학적 결함을 지닌 성체로 성장하였다. 반대로 RSK를 과발현시키면 이러한 세포분화현상이 저해되었으며, 이것은 Ras/ERK 신호전달계를 이루고 있는 유전자의 돌연변이에 의해 더욱더 심화되었다. 위의 생리학적 표현형과 일치하게 RSK는 ERK가 핵속으로 들어가는 것을 억제함으로써 ERK로 매개되는 발생학적 과정과 유전자 발현을 저해하였다. 더욱이, RSK 의존적인 ERK의 핵이동저해는 RSK의 효소학적 활성이 아닌 RSK와 ERK의 단백질간의 물리적인 결합으로 매개되는 것으로 나타났다. 다음으로 또다른 Ras/ERK 신호전달계의 저해인자로 알려졌던 MKP-3에 대한 생리적 기능을 연구하였다. 이미 이전의 연구를 통하여, 나는 포유류 Ras/ERK 신호전달계의 effctor인 ERK의 활성을 조절하는 유전자로 알려진 MKP-3를 초파리에서 과발현시킨 후 유전자기능 연구를 수행한 결과, MKP-3가 초파리 눈과 날개발생과정동안 세포운명 결정과 세포증식을 저해하는 유전자임을 알게 되었다. 여기서, 생체내 MKP-3 유전자의 생리학적 기능을 심도있게 조사하기 위해서 초파리 MKP-3 유전자 기능이 부분적으로 상실되거나 완전히 기능이 없는 돌연변이체를 만든후 이들 돌연변이체의 표현형과 Ras/ERK 신호전달계간의 관련성을 연구하였다. MKP-3 유전자 기능이 부분적으로 상실된 초파리는 눈의 광수용체 세포와 날개의 맥세포가 늘어난 것을 보였고, MKP-3 유전자가 완전히 결실된 초파리는 심각한 난자형성과정의 결함을 보이며, 배반포단계에서 더 이상 진행하지 못하고 죽게 된다. 이러한 결과는 MKP-3가 초파리 정상적인 발생과정에 매우 중요한 역할을 한다는 것을 제시한다. 그리고 기능상실된 MKP-3를 가진 초파리에서 보여진 표현형이 ERK활성이 증가된 초파리의 표현형과 매우 유사했으며, 유전적학적 상호작용 연구과 조직학적연구를 통해서 생체내 MKP-3가 Ras/ERK 신호전달계를 저해하고 있다는 것을 알게 되었다. 이상의 일련의 연구결과들을 통해서 RSK와 MKP-3에 의한 Ras/ERK 신호전달계의 생체내 조절기작들이 새로이 드러나게 되었다.
마지막으로, 면역체계의 새로운 저해인자를 찾기 위해서 과도한 면역반응을 보이는 돌연변이체를 얻기위한 유전학적 스크리닝을 수행하였으며, 이 연구 방법을 통해서 포유류의 Fas-associated factor와 homologous한 단백질인 caspar 돌연변이체을 동정하였다. 흥미롭게도, caspar 유전자 기능이 상실된 초파리는 세균감염에 대한 높은 저항성을 보였으며, 지속적으로 항세균성 펩타이드 유전자를 발현하였다. 반대로 caspar유전자가 과발현된 초파리는 감염된 상태에서 폭발적인 세균증식을 보이면서 감염 의존적인 항세균성 펩타이드 유전자 발현을 저해하였다. 유전학적 생화학적 연구를 통해서 나는 Caspar가 항세균성 면역반응을 일으키는 Imd 신호전달계의 핵심인자인 Relish (NF-kB)의 핵이동을 저해함으로써 Imd로 매개된 면역반응을 저해한다는 것을 보였다. 게다가, Relish의 핵이동의 필수조건인 DREDD 의존적인 Relish단백질의 절단과정이 Caspar로 매개된 Imd 신호전달계 저해의 타겟이다는 것을 보였다. 두드러지게, Caspar는 항세균성 면역반응은 저해하지만, 항진균성 면역반응은 전혀 영향을 주지 않는다는 것을 보였다. Imd 신호전달계의 새로운 저해인자인 Caspar를 밝혀낸 본 연구는 초파리와 포유류에 존재하는 면역반응에 대한 복잡한 조절 기작을 이해하는데 값진 통찰력을 제공할 것이다.
