Confocal microscopy has been getting popular in various fields such as biology, biomedical engineering and industry thanks to its unique optical sectioning property with relatively high rates of image acquisition over atomic force microscopy, scanning electron microscopy. It is also being perceived as an alternative of the realization of nano measurement technology which is the basic one of so-called nano technology (NT), information technology (IT), biotechnology (BT), etc.
Most real-time confocal microscopy uses beam scanning devices or rotating Nipkow disks to get three-dimensional images. Acoustic optic deflectors, polygon mirrors, and galvano mirrors are typical beam scanning units. However, they increase system complexity, and control electronics of them are mostly expensive. Vibrations caused by them result in decrease of signal-to-noise ratio and image distortion. Moreover, inherent loads by serial data collection limit the rates of image acquisition and subsequent processing. On the other hand, confocal microscopy having rotating Nipkow disks, spiral array of pinholes, has a problem of image degradation induced by optical cross talk among pinholes. It also suffers from low illumination efficiencies which restrict the use of the Nipkow disks to real-time applications.
In this thesis, spectrally encoded slit confocal microscopy (SESCoM) is proposed to eliminate the problems mentioned above. SESCoM uses spectral encoding technique and slit aperture as replacement of the beam scanning mechanism to make it possible to get two-dimensional images in real-time (more than 30 frames/sec) with nano resolution by the center wavelength of 405 nm and the high numerical aperture of 0.95. The spectral encoding technique is to encode one-dimensional lateral information of a specimen in wavelength by a diffraction grating and a broadband light source.
Analyses of SESCoM based on wave optics theory were conducted. The effect of slit width variation on the axial response of SESCoM is evaluated by numerical simulation. Then, the proper design point of slit width which directly affects depth discrimination of SESCoM is determined by a compromise between axial resolution and signal intensity. The two-dimensional imaging equation of SESCoM was derived to estimate the theoretical optical performance of SESCoM and to compare it with that of confocal microscopy.
Design of SESCoM was performed. Design variables and governing equations of SESCoM were derived and it was designed to satisfy Nyquist sampling theorem, to be diffraction limited, and to have the maximum illumination efficiency. The designed system had the field of view (FOV) of 51.2 um x 38.4 um with the theoretical axial full width at half maximum (FWHM) of 899 nm. Simulated lateral FWHMs of SESCoM along spectrally encoded axis (211 nm) and slit scan axis (221 nm) had the same optical performance with confocal microscopy and conventional optical microscopy, respectively.
Experimental results had verified the FOV of SESCoM with the image acquisition rate of 30 frames per second. The axial response of SESCoM showed asymmetric behavior which resulted in the FWHM error of 27.8% compared to the theoretical one. Experimental sections of intensity point spread functions, obtained by differentiating the edge responses, were wider than those of simulation results with the FWHM errors of about 11% along both axes.
In conclusion, SESCoM is distinguished from typical confocal microscopy in an aspect of its real-time imaging capability, in principle, possibly up to tens of thousands of frames per second at a low cost. SESCoM is expected to have high potential as the measurement equipment for the whole inspection in various industries and might also contribute to miniaturization of confocal microscopy.
나노 측정 기술은 최근 나노기술(NT), 정보기술(IT), 생명기술(BT) 등 여러 첨단 기술의 기초기반 기술로 인식되고 있으며, 100 nm 이하의 측정 분해능 및 실시간 측정 능력을 요하고 있다. 공초점 현미경은 나노 측정 기술을 구현하기위한 하나의 대안으로 주목받고 있으며, 특유의 광학적 절편 효과가 있어 시편 내부를 관찰할 수 있고 3차원 형상 복원 능력을 가진다는 특징이 있다. 때문에 산업용 검사 장비뿐만 아니라 생의학용 검사 장비로도 그 응용이 확대되고 있다. 공초점 현미경은 주사 과정을 통해 2차원 영상을 획득한다. 여러 주사 방법 중 음향광학편향기, 다각거울 혹은 갈바노 거울을 이용한 단일점주사 방식의 경우 전자제어장치가 고가이고 시스템 구성이 복잡해지며, 측정 시 진동이 발생하는 단점이 있다. 또한 시편 정보를 직렬로 검출하기 때문에 영상의 획득, 처리 및 표시에 계산 하중이 크다. 단일점주사 방식의 하나로 최근에 개발된 MEMS 주사 장치도 아직까지는 작동의 안정성 및 신뢰성 부분과 관련한 연구가 필요한 실정이다. 한편, Nipkow disk를 이용한 다수점주사 방식의 경우 시스템이 복잡하고 고가이며 조명 효율이 낮은 문제점이 있다. 더욱이 홀 간의 cross talk 때문에 횡방향 분해능의 저하가 발생한다. 본 논문에서는 나노 분해능 및 실시간 영상 획득이 가능한 새로운 형태의 반사형 공초점 현미경(SESCoM)을 제안한다. SESCoM은 중심 파장이 405 nm, 대물렌즈의 수치구경이 0.95로 회절한계 내에서 고분해능을 얻을 수 있으며, 고가의 주사 장치 대신에 파장 코딩 기술과 슬릿 개구를 이용함으로써 고속 측정이 가능한 시스템이다. 파장 코딩 기술은 대물렌즈 초점 평면의 일차원 공간 정보를 각기 다른 파장으로 인코딩하는 것으로, 광대역 광원과 회절 격자를 이용하여 구현하였다. 시스템의 설계 이전에 광학계를 파동 광학적으로 분석하였다. 광학계의 성능에 결정적인 영향을 미치는 슬릿의 폭이 종방향 분해능 및 측정 신호 강도에 미치는 영향을 알아보기위해 광학계의 강도 점퍼짐함수을 유도하고 광축 응답 특성을 시뮬레이션 하였다. 슬릿 폭의 설계 기준으로 종방향 분해능이 이상적인 경우에 비해 50% 감소하고 측정 신호 강도가 75%되는 지점을 선택하였다. 한편, 파장 코딩 효과의 영향을 반영한 SESCoM의 2차원 결상 방정식을 유도하여 광학계의 횡방향 성능을 이론적으로 예측할 수 있도록 하였다. 광학계의 설계 변수 및 지배 방정식을 유도하였으며, Nyquist 샘플링 기준을 만족하면서 회절한계 성능을 갖는 광학계를 설계하였다. 설계된 시스템의 횡방향 성능을 예측하기위해, 매개변수 값들과 2차원 결상방정식으로부터, 시뮬레이션을 통해 2차원 강도 점퍼짐함수를 얻었다. SESCoM은 FOV 내에서 파장코딩축 방향으로는 공초점 현미경과 같은 성능을 가지며, 슬릿의 길이 방향으로는 일반 광학 현미경과 동일한 성능을 가지는 것으로 나타났다. 실험적으로 SESCoM의 FOV가 53 um x 40 um (640 x 480) 정도로 설계치를 만족함을 검증하였다. 또한 시편을 횡방향으로 빠르게 움직이면서 영상을 획득하는 통특성 실험을 통해 SESCoM이 고속 측정을 갖추었음을 검증하였다. 실험적으로 구한 광축 응답 함수는 시뮬레이션 결과를 잘 따랐고, 슬릿이 없는 일반 광학 현미경의 광축 응답 함수와 비교함으로써 특유의 깊이 분별력 특성을 확인하였다. 반면 광축 응답 특성의 비대칭 특성 때문에 FWHMz가 1149 nm로 이론치와 27.8%의 오차를 가졌다. 그리고 설계된 시스템은 FOV 내에서 광축 응답 특성의 변화 정도가, FWHM 측면에서, 약 12%임을 확인하였다. 한편, 실험적으로 얻어진 edge 응답을 미분하여 SESCoM의 2차원 강도 점퍼짐함수 단면을 구했으며, FWHM 값이 시뮬레이션 결과와 비교하여 약 11%의 오차를 가졌다. SESCoM은 작동원리상 10,000 frames/sec 이상의 고속 측정 능력도 쉽게 갖출 수 있다는 측면에서 타 공초점 현미경과 차별성을 가진다. 뿐만 아니라 광학계의 구조가 간단하고, 요소품이 저가이며, 쉽게 소형화 할 수 있다는 장점이 있다. 이 때문에 산업용 고속 측정 장비로의 응용 가능성이 매우 높다.
