The cellular and molecular mechanisms underlying the development and maintenance of dendritic spines are not fully understood. ARF6 is a small GTPase known to regulate actin remodeling and membrane traffic. I studied involvement of ARF6 and EFA6A, an ARF6-specific exchange factor, in the regulation of spine development and maintenance. An active form of ARF6 promotes the formation of dendritic spines at the expense of filopodia. EFA6A promotes spine formation in an ARF6 activation-dependent manner. Knockdown of ARF6 and EFA6A by siRNA decreases spine formation. Live imaging indicates that ARF6 knockdown decreases the conversion of filopodia to spines and the stability of early spines. The spine promoting effect of ARF6 is partially blocked by Rae 1. ARF6 and EFA6A protect mature spines from inactivity-induced destabilization. These results suggest that ARF6 and EFA6A may regulate the conversion of filopodia to spines and the stability of both early and mature spines.
중추신경계에서 신경세포의 dendrite에는 spine이라 불리는 돌기모양의 구조물이 있는데, 이 spine은 중추신경계 신경세포에서 대부분의 흥분성 신경정보 전달이 이루어 지는 장소이며 actin-rich 구조물이다. Spine은 시냅스의 형성, 시냅스의 기능, 시냅스의 가소성뿐만 아니라 정신지체와 같은 뇌질환과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. Spine이 형성되는 메커니즘에 대한 가설 중에서 가장 보편적으로 받아들여지고 있는 것 중에 하나가 ‘filopodia-to-spine’ 가설인데, 이는 먼저 dendrite에서 filopodia라는 길쭉한 돌기가 튀어 나오고 이 filopodia가 axon과 만나면 axon을 dendrite로 끌어오면서 filopodia가 spine의 형태로 발전되고 시냅스가 형성된다는 것이다. 하지만 이러한 filopodia에서 spine으로 발전하는 세포생물학적 현상에 대해서는 많이 연구가 되지 않았다.
ADP ribosylation factor (ARF)는 Ras-related family of small GTPase이며 actin cytoskeleton과 membrane traffic을 조절하는 것으로 알려져 있다. 여섯개의 isoform 중에서 ARF6는 plasma membrane에 특이적으로 위치하고 있으며 actin cytoskeleton, 수용체 endocytosis와 endosome recycling을 조절하는 단백질이다. 그리고 ARF는 guanine nucleotide exchange factor (GEF) 단백질에 의해 활성화되는데 ARF6만 특이적으로 활성화시키는 GEF 단백질 중에 하나가 바로 EFA6A (exchange factor for ARF6)이다. 이 두 단백질의 뇌조직에서의 시공간적 발현양상을 동정하여 보았을 때, 두 단백질 모두 시냅스에 해당하는 부분에 존재함을 알 수 있었고, 그 발현 양상이 부분적으로 일치함을 알 수 있었다.
이 두 단백질의 신경세포에서의 기능을 알아보기 위해 과발현 실험과 발현억제 실험을 수행하였다. ARF6의 active form을 배양신경세포에서 과발현시켰을 때, filopodia의 수가 줄어드는 반면 spine의 수가 증가함을 알 수 있었다. 그리고 EFA6A를 과발현시켰을 때 역시, ARF6를 activation시킴으로써 spine 형성을 촉진시키는 결과를 얻었다. 반대로 small interfering RNA(siRNA)를 이용하여 ARF6와 EFA6A의 발현을 억제시켰을 때, spine 형성이 억제되는 반면 filopodia의 수는 증가함을 알 수 있었다. 그리고 live imaging 실험을 통하여 ARF6의 발현을 억제시키면 filopodia에서 spine으로의 변환이 저하되고 초기 spine들의 안정성이 감소하는 것을 직접적으로 증명하였다. 또한 이러한 ARF6의 효과가 Rac1의 dominant negative form을 동시에 과발현시켰을 때 상당히 억제되는 것으로 보아 ARF6의 downsteam effector로 Rac1이 중요한 역할을 하고 있다는 것을 알 수 있었다. 마지막으로 배양 초기의 신경세포에서 ARF6와 EFA6A가 앞서 언급한 바와 같이 filopodia에서 spine으로의 전환에 관여할 뿐만 아니라 배양 후기의 성숙된 신경세포에서 spine의 안정성에도 관여하고 있음을 증명하였다. 본 연구는 ARF6와 EFA6A, 두 단백질을 대상으로 배양신경세포에서 과발현, 발현억제, live imaging 실험 등을 수행함으로써 이 두 단백질이 신경세포에서 초기의 filopodia를 spine으로 변환시킬 뿐만 아니라 spine을 안정화시키는 역할을 하고 있다는 것을 밝힌 연구이다.
