Aberrant Notch signaling contributes to more than half of all human T-cell leukemias. Accumulating evidence indicates Notch involvement in other human neoplasms. To investigate the possible role of Notch in the regulation of p63, one of the p53 family proteins, which induces the expression of several target proteins involved in cell cycle arrest and apoptosis, I examined the effect of Notch signaling on the transactivation functions of p63. Ectopic expression of activated human Notchl (Nl-IC) represses p63 transactivation. Data show that p63 protein levels are reduced by the expression of N1-IC in HCT116 p53-/- cells. Data further suggest that proteasomedependent degradation of protein did not result in the decrease of p63 protein levels by Nl-IC. The transactivation of NI-IC is attributable to the decrease of p63 protein levels since Notchl-ARAM mutant which lacks the ability of Nl-IC to transactivate its target genes did not reduce levels of p63 protein. I showed that Notchl suppresses transcription of p63 in RT-PCR analysis. Therefore, this study concludes that Nl-IC mediates suppression of p63 transactivation by inhibiting transcription of p63.
본 연구에서는 Notch1이 p63의 전사활성에 미치는 영향을 조사하였다. HCT116 p53-/- 세포에서 과발현시킨 N1-IC는 TAp63γ의 전사활성을 크게 저해하였다. 이러한 전사활성 억제를 확인하기 위해 RT-PCR과 Western blotting을 수행한 결과 TAp63γ에 의해 증가한 p21의 mRNA 양과 단백질 양 모두 N1-IC의 과발현에 의해 감소하는 것을 확인하였다. N1-IC의 발현량이 늘어남에 따라 과발현시킨 TAp63γ의 단백질 양이 줄어든다는 현상 또한 발견할 수 있었다. Notch1 siRNA를 이용한 knockdown 실험을 통해 이러한 현상이 사실임을 확인하였다. 그리고 Notch1-ΔRAM을 이용한 실험을 통해 Notch activity가 TAp63γ 단백질 양의 감소에 중요하다는 사실을 확인하였다. Notch1이 TAp63γ의 단백질 양을 감소시키는 기작을 proteasome에 의한 단백질 분해, p63의 발현 억제라는 두 가지 측면에서 확인해 보았다. 우선, MG132 (proteasome 억제제)의 처리는 Notch1에 의한 TAp63γ 단백질 양 감소에 영향을 미치지 못했다. RT-PCR을 통한 TAp63γ mRNA 양을 조사해 본 결과 N1-IC의 과발현이 TAp63 mRNA 양을 줄이는 것을 확인하였다. 이러한 실험 결과를 바탕으로 Notch가 TAp63의 전사를 억제하여 단백질 양을 줄임으로써 TAp63 단백질의 전사 활성을 억제함을 밝힐 수 있었다.