Poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid) hydrogel nanoparticles were prepared by free radical copolymerization of N-isopropylacrylamide and acrylic acid in the presence of crosslinker above lower critical solution temperature (LCST). They exhibited a reversible swelling and deswelling behavior: ca. 200 nm diameter below the LCST and ca. 100 nm diameter above the LCST. The nanoparticles were tagged with fluorescent dye (FITC) in order to monitor the extent of cellular uptake and were further modified with galactose moieties to evaluate the extent of receptor-mediated endocytosis against HepG2 cells. Flow cytometry and confocal microscopy were used to investigate cellular uptake behaviors of the nanoparticles. It was found that the extent of cellular uptake of nanoparticles was far greater above the LCST than below the LCST, suggesting that smaller nanoparticles were taken up more readily within cells. When the nanoparticles were galactosylated, the extent of cellular uptake increased dramatically due to receptor-mediated endocytosis.
Novel Pluronic/heparin composite nanocapsules that exhibit a thermally responsible swelling and deswelling behavior were synthesized. Pluronic F-127 pre-activated with pnitrophenyl chloroformate at its two terminal hydroxyl groups was dissolved in a methylene chloride phase. The organic phase was dispersed in an aqueous phase containing heparin. At an organic/aqueous interface, Pluronic-crosslinked heparin nanocapsules were produced. They exhibited a 1,000-fold volume transition (ca. 336 nm at 25℃; ca. 32 nm at 37℃), and a reversible swelling and deswelling behavior when the temperature was cycled between 20℃ and 37℃. The reversible volume transition of Pluronic nanocapsules was caused by micellization and demicellization of cross-linked Pluronic polymer chains within the nanocapsule structure in response to temperature. The morphological characters were investigated with transmission electron microscopy and small angle neutron scattering. Pluronic/heparin nanocapsules had an aqueous fluid-filled hollow interior with a surrounding shell layer below the critical temperature, but they became a collapsed core/shell structure similar to that of Pluronic micelles above it.
Pluronic hydrogel nanoparticles crosslinked with poly(ethylenimine) (PEI) were synthesized by modified emulsification/solvent evaporation method. Terminally pre-activated Pluronic F-127 with p-nitrophenyl chloroformate was dissolved in dichloromethane, and then the organic solution was emulsified in deionized water containing PEI by sonication. Primary amine groups of PEI in the aqueous phase were conjugated with activated Pluronic F-127 in the vicinity of water/dichloromethane interface, resulting in the formation of shell-crosslinked Pluronic/PEI nanocapsules. Pluronic/PEI nanocapsules exhibit a volume transition behavior over the temperature range of 24 - 33 ℃. The thermally reversible swelling/deswelling of Pluronic/PEI nanocapsules was caused by temperature-dependent hydrophobic interaction of crosslinked and/or grafted Pluronic polymer chains in the nanocapsules. The Pluronic/PEI nanocapsules were utilized to break up an intracellular endosomal compartment for cytosolspecific delivery of various bioactive agents.
약물전달체계가 발전함에 따라서 보다 다양한 기능을 가진 약물전달체계의 개발이 요구되고 있다. 이러한 약물전달체계는 대상 약물을 신체내의 원하는 부위에 전달할 수 있어야 하고, 경우에 따라서는 특정 세포내의 부위로 전달이 가능해야 한다. 온도 민감성 하이드로겔 나노 입자는 그 특유의 온도 민감성과 나노 크기의 작은 입자라는 장점을 가져 가장 이상적인 차세대 약물전달체계로 널리 연구되고 있다.
본 연구에서는 3가지의 다른 구조를 가진 온도 민감성 하이드로겔 나노 입자를 합성하여 그 특성을 분석하였다. 첫 번째로 온도 민감성을 가지는 PNIPAAm과 acrylic acid의 공중합체로 구성되는 하이드로겔 나노 입자를 합성하여 세포 내로 들어가는 양상을 연구하였다. 하이드로겔 나노 입자의 세포 내 진입은 온도를 LCST이상으로 올려 나노 입자의 크기를 작게 하거나 나노 입자에 세포 특이적인 ligand를 도입하는 것에 의해 증가된다. 온도가 LCST보다 높아질 경우 나노 입자의 크기는 줄어들게 되고, 동시에 숨어있던 세포 특이적인 ligand는 나노 입자의 표면에 노출된다. Ligand로서 Galactose를 도입한 나노 입자의 경우 galactose ligand를 도입하지 않은 경우보다 galactose 특이적인 수용체인 asialoglycoprotein을 가지고 있는 HepG2 세포 내로 훨씬 많은 양이 들어간다. 이러한 현상은 수용체를 매개로 세포 내로 나노 입자가 들어갔기 때문이다. 이러한 결과의 의미는 나노 입자의 크기가 작을수록 세포 내로 전달이 더욱 용이하게 이루어 지며 세포 특이적인 ligand가 있을 경우 세포 내로 들어가는 정도가 더욱 커짐을 의미한다. 온도 민감성 하이드로겔 나노 입자는 온도를 조절하여 이러한 세포 내 진입을 조절할 수 있음을 의미한다.
두 번째로, 새로운 온도 민감성 나노 캡슐을 합성했다. 이러한 나노 캡슐은 25~33도 사이에서 급격한 부피 변화를 보이며 온도 변화에 따라 가역적으로 그 크기가 변하는 현상을 보였다. Pluronic과 헤파린이라는 생체 적합성 고분자를 이용하여 만든 이 나노 캡슐은 구성 성분 중 하나인 Pluronic이 온도 변화에 따라 micelle을 이루려는 현상을 보이는 것을 이용하여 온도 따른 부피 변화를 이끌어 냈다. TEM 사진을 보면 온도를 낮추었을 대 팽창하여 속이 비어있는 캡슐 구조를 가지고 있을 보여주었다. 중성자 소각 산란법(SANS)을 이용하여 분석한 결과 Pluronic/헤파린 나노 캡슐은 수축했을 때 core-shell 구조를 가짐을 알 수 있었다.
세 번째로 온도 민감성을 가진 Pluronic/PEI 나노 캡슐을 합성했다. 이러한 나노 캡슐은 세포 내로 들어갔을 때 온도 변화에 따라 팽창하여 세포 내 기관인 endosome을 깨는 것을 목적으로 연구를 수행하였다. Pluronic/헤파린 나노 캡슐과 마찬가지로 20~37도 사이에 급격한 부피 변화를 보였고 수축했을 때의 크기가 100 nm였다. TEM 사진을 보면 Pluronic/헤파린 나노 캡슐과 달리 부피가 줄어들기 전, 후 모두 속이 비어있는 구조를 보였다. 이러한 결과는 소수성 반응에 의해 나노 입자가 수축하는 과정에서 강한 양전하를 띄는 PEI가 서로 밀어내는 작용을 하여 수축이 멈춘 것으로 생각된다. Pluronic/PEI나노 캡슐을 만들 때 넣어주는 Pluronic의 농도를 조절하면, 나노 캡슐의 부피가 변하는 정도를 조절할 수 있다. 이러한 방법을 이용해서 세포 내에서 부피 팽창으로endosome을 깰 수 있는지를 HeLa cell을 통하여 연구하였다. 세포 내로 나노 입자가 들어간 후 cold-shock을 주었을 때 confocal 현며경으로 관찰한 결과 endosome이 없어지고 나노 캡슐이 endosome밖 cytosol로 빠져 나옴을 확인할 수 있었다.
이러한 온도에 따라 가역적으로 크기가 변하는 하이드로겔 나노 입자는 온도에 따라 세포 내로 들어가는 정도가 조절되고, 더 나아가 세포 내 소기관을 온도 변화에 따라 특이적으로 탈출할 수 있음을 본 연구를 통해 알 수 있었다. 따라서 항암제, 단백질, 펩타이드, 유전자 약물, 조형제 등의 약물을 온도 민감성 하이드로겔 나노 입자를 통해 제형을 개발 할 경우 온도에 따른 약물의 방출이 조절이 되고 목표로 하는 세포 내부에서 직접 작용이 가능한 효과적인 약물 전달 체계의 개발이 가능하다.
