A gene encoding xylitol dehydrogenase (XDH) of Candida tropicalis ATCC 20913 was cloned and characterized. The 1,095-bp coding sequence of the XYL2 gene encodes a polypeptide of 364 amino acids, with a molecular mass of 39.4 kDa. The XYL2 gene of Candida tropicalis was disrupted by sequential gene replacement using Ura-blasting method. The XYL2-disrupted mutant, BSXDH-3, could not grow on a minimal medium containing D-xylose as a sole carbon source. Enzyme assay experiment indicated that BSXDH-3 lost apparently all XDH activity. Xylitol production by BSXDH-3 was evaluated using xylitol fermentation medium containing glucose as a co-substrate. Since glucose was not sufficient as a co-substrate, various carbon sources were screened for efficient cofactor regeneration. Glycerol was selected as the best co-substrate and, subsequently, the optimization of fermentation condition was carried out. As the result of experiments, BSXDH-3 produced xylitol with a volumetric productivity of 3.23 $g1^{-1}h^{-1}$ a specific productivity of 0.76 g$g1^{-1}h^{-1}$, and a xylitol yield of 98 %. This is the first report of gene disruption of C. tropicalis for enhancing the efficiency of xylitol production and will be a turning point of process development for xylitol production.
자일리톨(Xylitol)은 오탄당 알코올로서 설탕과 감미도는 같으면서 열량은 적고, 구강 내의 충치 유발균 성장을 억제하고 산의 합성을 유발하지 않는 장점으로 식품산업에서의 이용이 증가하고 있다. 현재 자일리톨은 자연계에 풍부한 반섬유소의 구성 물질인 자일로스로부터 화학적인 수소첨가반응으로 생산하고 있다. 하지만 화학적인 생산 방법은 다단계 분리정제과정으로 인한 고비용, 공정의 위험성, 공해 유발의 문제점을 가지고 있어, 저비용 고수율의 생물학적인 방법에 의한 자일리톨 생산기술이 연구개발되고 있다. 특히 높은 자일로스 이용능력을 갖고 있는 캔디다속의 효모균주에 의한 자일리톨 생산 방법이 주목받고 있다. 하지만, 기존 효모균주에 의한 생산 방법에서는 생산된 자일리톨이 세포의 성장과 유지에 이용되어 생산수율이 70 - 80 %에 재한되는 한계가 있었다.
본 연구에서는 효모 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)의 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase; XDH)를 유전공학적 방법으로 제거하여 고수율의 자일리톨 생산공정을 구축하였다. 이를 위해 우선 C. tropicalis XDH 유전자를 클로닝하고 효소의 활성을 분석하였다. XDH 유전자(XYL2)는 1,095개의 염기쌍으로 구성되어 있었으며, 364개의 아미노산으로 이루어진 효소의 크기는 39.4 kDa이었다. XDH는 D-자일로스에 특이적인 활성을 보였으며 조효소로 $NAD^+$ 를 이용하였다. 밝혀진 유전자 염기서열을 바탕으로 두가지의 유전자제거 카세트를 제작하고, 이를 이용하여 C. tropicalis XYL2 유전자를 선택적으로 제거하였다. 이를 통해 구축된 XYL2-결핍 C. tropicalis 변이주 BSXDH-3는 탄소원으로 자일로스만 함유된 성장배지에서 자랄 수 없었고, 포도당이 보조기질로 함유된 자일리톨 생산배지에서 100 %에 가까운 수율로 자일리톨을 생산할 수 있었다.
하지만, 포도당은 세포내로의 자일로스의 섭취를 억제하는 특성을 갖고 있어서 자일리톨 생산을 방해하므로 다른 보조기질의 탐색을 수행하였고, 그 결과 글리세롤이 자일리톨 생산에 필요한 조효소인 NADPH를 공급하기에 가장 적합한 보조기질로 선택되었다. 추가적인 자일리톨 생산배지 조성의 최적화와 산소공급의 조절을 통해서, 결과적으로 XDH 유전자가 제거된 변이주를 이용하여 $3.23 g l^{-1} h^{-1}$ 의 생산성과 $0.76 g g^{-1} h^{-1}$ 의 비생산성, 98%의 생산수율로 자일리톨을 생산하는 공정을 개발 할 수 있었다. 이 연구결과는 기존에 연구된 생물학적인 자일리톨 생산방법과 비교하여 수율과 비생산성 면에서 월등하게 향상된 결과이다. 또한 본 변이주를 이용하면 자일리톨 생산 시 용존산소를 낮게 조절할 필요가 없는 간단한 공정이 가능하다. 본 연구에서 이용된 대사공학을 이용한 균주개발 방법은 다른 대사물질 생산공정 개발에도 응용될 수 있다.
