Apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1) is a MAP kinase kinase kinase that mediates apoptosis signaling. To investigate the possible role of ASK1 in regulating E2F1, we examined the effect of ASK1 on transcriptional activity of E2F1. E2F1 is known as a transcription factor which induces several proteins involved in cell cycle, especially in G1/S transition. This study presents the biochemical and functional interactions between ASK1 and E2F1. ASK1 represses E2F1 transcriptional activity. Data further show that the stability of E2F1 by ASK1 doesn’t be affected and kinase activity of ASK1 is not crucial for E2F1’s activity. C-terminal deletion mutant of ASK1 is unable to repress the transcriptional activity of E2F1. Moreover, in vivo binding result shows an interaction between ASK1 and E2F1 and the C-terminal region of ASK1 interacts with E2F1. Therefore, we conclude that ASK1-mediated E2F1 suppression is caused by interaction between ASK1 and E2F1. Based on our data, this study proposes that ASK1 plays an important role in regulating E2F1 transcriptional activity as well as in regulating apoptosis.
ASK1 단백질은 세포 예정사를 촉진하는 인산화 효소로 잘 알려져 있다. 다양한 Death 자극에 의해 활성화된 ASK1 단백질은 JNK 또는 p38 MAPK를 활성화시켜 세포 예정사를 촉진한다. E2F1단백질은 세포가 G1기에서 S기로 넘어갈 때 필요한 여러 유전자의 전사 조절 인자로 잘 알려져 있다.
본 연구에서는 E2F1의 전사활성에 ASK1이 미치는 영향을 조사하였다. HeLa 세포에서 과발현시킨 ASK1은 E2F1의 전사활성을 크게 저해하였다. 이러한 전사활성의 기작을 E2F1의 단백질 발현양, ASK1의 인산화 효소 활성의 영향, 그리고 두 단백질간의 결합적인 측면에서 확인해보았다. ASK1은 E2F1의 세포내 발현에 아무런 영향을 미치지 못했고 ASK1 인산화 효소의 활성이 없는 돌연변이 ASK1(ASK1 K709R)는 ASK1 과 마찬가지로 E2F1의 전사를 크게 저해한 것으로 나타나 E2F1의 전사활성억제에는 인산화 효소 활성이 관여하지 않음을 알 수 있었다. 특이하게 카르복실기가 없는 돌연변이는 E2F1의 전사활성을 억제하지 못하였는데 두 단백질간의 상호작용을 조사해 본 결과 두 단백질이 HeLa세포에서 결합함을 확인하였고 그 결합부위는 ASK1의 C-terminal 부위임을 알아냈다. 이러한 결과를 바탕으로 ASK1에 의한 E2F1의 전사억제는 두 단백질간의 결합을 통해 이루어짐을 알 수 있었다. ASK1과 E2F1간의 endogenous 결합이 HeLa세포에서 일어나는 것을 또한 확인하였으며 여러 세포(293,HCT116-/-, COS세포)에서 실험한 결과 두 단백질의 결합이 HeLa세포에만 국한된 것임이 아님을 확인하였다. 이러한 실험 결과를 바탕으로 ASK1이 E2F1의 전사 억제자로 작용함을 밝힐 수 있었다.
