The major objective of this study was to develop a recombinant E. coli strain, to identify fed-batch culture conditions optimal for the production of human interleukin-6 (hIL-6) in cytoplasm in a soluble form. Five expression vectors were developed for the expression of hIL-6 and hIL-6s fused with NusA, maltose binding protein (MBP), thioredoxin (Trx) or ubiquitin (Ubi). A series of flask cultures were conducted in LB medium at 37℃. The intact hIL-6 was expressed mostly in the form of inclusion body. More than 95% of the hIL-6 fused with NusA (NusA/hIL-6) and about 90% of MBP/hIL-6 were expressed in a soluble form, while Trx/hIL-6 and Ubi/hIL-6 were expressed mostly in the form of inclusion body. Based on this result, NusA was selected the fusion partner for the production of hIL-6 in the subsequent experiments. A series of pH-stat fed-batch cultures of E. coli BL21(DE3) transformed with the NusA/hIL-6 expression vector were conducted in a bioreactor with a working volume of about 3 liters. As the amount of nitrogen source was increased in the feeding medium, the fraction of soluble NusA/hIL-6 increased about 4-folds, while the total amount rather slightly increased. Under the best conditions tested, about 90% of NusA/hIL-6 was produced in the soluble form. The concentration of soluble NusA/hIL-6 was 7.5 g/L with a volumetric productivity of 0.41 g/L-h. The expression of NusA/hIL-6 was confirmed by western blot analysis. The bioefficacy of the NusA/hIL-6 produced was investigated by cell proliferation assay. The hIL-6 activity of NusA/hIL-6 in the cell lysate was 60 ~ 82% of that of the standard hIL-6. A comparative proteome analysis by two-dimensional electrophoresis (2-DE) was carried out to investigate proteins expression patterns in fed-batch cultures. The introduction of NusA was observed to induce several cellular proteins including molecular chaperones such as DnaK, groEL, and trigger factor. The existence of the molecular chaperones was considered to have helped protein folding making the fraction of soluble NusA/hIL-6 dramatically increase. When the amount of yeast extract in the feeding medium was increased, the expression of groES and other proteins involved in the small-molecules metabolism and glucose uptake was significantly enhanced.
본 연구의 주된 목적은 대장균 세포질 내에서의 수용성 형태의 인간 인터루킨-6 (hIL-6) 생산에 가장 적합한 재조합 대장균을 개발함과 동시에 유가식 배양 조건을 최적화하는데 있다. 인간 인터루킨-6 및 융합 인간 인터루킨-6 (fusion hIL-6)의 대장균 세포질 내에서의 발현을 위해 5개의 서로 다른 발현 벡터들이 개발되었다. 융합 파트너로는 NusA, maltose binding protein (MBP), thioredoxin (Trx), 그리고 ubiquitin (Ubi) 등이 도입되었다. 플라스크 배양은 LB 배지를 이용하여 37℃ 에서 이루어졌고, 그 결과 hIL-6는 모두 비용해성 결합체 (inclusion body) 의 형태로 발현됨을 알 수 있었다. 또한 융합 hIL-6의 경우 NusA와 MBP가 융합된 hIL-6는 수용성 형태로 발현이 이루어졌고, 반면 Trx와 Ubi가 융합파트너로서 도입된 경우에서는 융합 hIL-6가 모두 비용해성 결합체로 발현이 이루어짐을 알 수 있었다. 특히, NusA가 융합된 hIL-6 (NusA/hIL-6)의 경우 수용성 형태로의 발현 비율이 MBP가 융합된 hIL-6 (MBP/hIL-6)보다 현저히 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과로부터, NusA가 수용성 형태로의 hIL-6 생산에 보다 적합한 융합파트너임이 확인되었고, 따라서 이 후의 모든 유가식 배양에 NusA/hIL-6 발현 벡터가 이용되었다.
인간 인터루킨-6를 수용성 형태로 과 생산하기 위해 유가식 배양을 수행하여 배양 조건을 최적화 하였다. 기질공급은 pH-stat 방식에 의해 이루어 졌다. 탄소원인 포도당의 공급량을 최적화 함으로서 아세트산 생성을 최소화하면서 NusA/hIL-6 생산을 극대화 할 수 있었다. 또한 수용성 형태로의 NusA/hIL-6 생산을 극대화하기 위해 질소원인 효모 추출액 (yeast extract, YE)의 공급량을 최적화 하였다. 결론적으로, 수용성 형태의 NusA/hIL-6 생산에 가장 적합한 포도당 및 효모 추출액의 공급량은 각각 3 g-포도당과 0.9 g-YE 이었다. 이 조건하에서의 유가식 배양결과, 생산된 NusA/hIL-6의 약 90 %가 수용성 형태로 존재함을 알 수 있었다. 이 경우 수용성 형태로 생산된 NusA/hIL-6의 최대 농도 및 생산성은 각각 7.5 g/L 및 0.41 g/L-h 이었다. 생산된 단백질은 western blotting을 통해서 hIL-6임이 확인되었다. 또한 생산된 단백질의 hIL-6 활성은 cell proliferation assay를 통해 측정되었고, 그 결과 표준 hIL-6의 활성에 대해 약 60 ~ 82 %의 효능을 가지는 것으로 나타났다.
유가식 배양 동안의 NusA/hIL-6 발현에 따른 재조합 대장균 내 단백질들의 발현 패턴을 고찰하기 위해 이차원 전기영동에 의해 대장균 단백체를 비교 분석하였다. NusA가 융합됨으로써 DnaK, groEL, 그리고 Trigger Factor와 같은 molecular chaperone들을 포함한 수 개의 세포 내 단백질들의 발현이 유도되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 이러한 Molecular chaperone들이 세포 내에서 발현됨으로써 NusA/hIL-6의 단백질 접힘이 촉진되고, 이에 따라 NusA/hIL-6의 수용성 발현이 극대화 되는 것으로 사료된다. 또한, 유가식 배양 중의 NusA/hIL-6 과 발현 시, 효모 추출액을 충분히 공급해 줌으로서 대장균 세포질 내에서 groES와 같은 molecular chaperone 및 저 분자 대사와 포도당 흡수에 관여하는 많은 단백질들의 발현이 아주 활발히 이루어짐을 알 수 있었다.
