To enhance the performance of a serum-free medium (SFM) for human thrombopoientin(hTPO) production in suspension cultures of recombinant Chinese hamster ovary (rCHO) cells, several low-cost hydrolysates such ans yeast hydrolysate(YH), soy hydrolysate, wheat gluten hydrolysate and rice hydrolysate were tested as medium additives. Among various hydrolysates tested, the positive effect of YH on hTPO production was most significant. When 5 g/l YH was added to SFM, the maximum hTPO concentration in batch culture was 40.41 ㎍/ml, which is 11.5 times higher than that in SFM without YH supplementation. This enhanced hTPO production in YH-supplemented SFM was obtained by the combined effect of enhanced $q_{hTPO}$(the specific rate of hTPO production) and increased culture longevity. The supplementation of YH in SFM increased $q_{hTPO}$ by 294% and extended culture longevity by >2 days if the culture was terminated at a cell viability of 50%. Furthermore, cell viability during the culture using YH-supplemented SFM was higher than that using any other hydrolysate-supplemented SFM tested and thereby, degradation of hTPO susceptible to proteolytic degradation could be minimized. In addition, YH supplementation did not affect in vivo biological activity of hTPO. Taken together, the results obtained domonstrate the potential of YH as a medium additive for hTPO production in serumfree suspension cultures of rCHO cells.
hTPO is a heavily glycosylated protein with 6 and 24 potential N- and O- glycosylation sites, respectively. To determine the effect of sodium butyrate(NaBu) on the production and quality of hTPO in rCHO cells, NABu(0-10 mM) was added to the cultures of exponentially growing cells. NaBu addition significantly increased both the specific and volumetric hTPO production, although it decreased the cell viability by apoptosis in a dose-dependent manner. The highest hTPO concentration of 82.2 ± 5.6 ㎍/ml was obtained in the culture with 3 mM NaBu addition. Compared with the culture without NaBu addition, the culture with 3 mM NaBu resulted in a 6.4-fold increase in $q_{TPO}$ and a 3.3-fold increase in th fianl hTPO concentration on day 7. However, NaBu deteriorated the quality of hTPO, resulting from increased heterogeneity, reduced acidic hTPO isoforms, reduced a(2→3) sialyation, and decreased in vivo biological activity. We also found that the biological activity of hTPO in the culture with 3 mM NaBu addition collected on day 7 was 72% of that in the culture without NaBu addition. Taken together, the use of NaBu or its optimal concentration for high-level expression of a heavily glycosylated protein like hTPO should be determined by considering its detrimental effect on the quality of glycoprotein.
To overcome detrimental effects of NaBu on apoptotic cell death and hTPO quality, I overexpressed Bcl-2 protein, an antiapoptotic protein, in rCHO cells producing hTPO. Compared to serum-free suspension culture of control cells without Bcl-2 overexpression(R-neo cells) and NaBu addition, a more than 10-fold increase in the maximum hTPO concentration was obtained in serum-free suspension culture of cells with Bcl-2 overexpression(R-bcl2-14 cells) and 3 mM NaBu addition. Both the enhanced specific productivity endowed by NaBu and the extended culture longevity provided by the antiapoptotic effect of Bcl-2 overexpression contributed to the enhancement of maximum hTPO concentration. The problem of quality reduction of hTPO induced by NaBu was not solved by Bcl-2 overexpression, but it was not that significant. Compared to the culture in the absence of NaBu, the percentage of hTPO isoforms in pI 3-5 with high in vivo biological activity produced by R-bc12-14 cells was decreased by approximately 18% in the presence of 3 mM. As a result, a more than 6-fold increase in the production of hTPO isoforms in pI 3-5 was achieved in R-bcl2-14 cell culture with 3 mM NaBu addition. Taken together, the data obtained suggest that Bcl-2 overexpression in rCHO cells and NaBu addition in serum-free suspension culture can be an effective means to enhance the production of highly glycosylated protein like hTPO.
To overcome this cytotoxic effect of NaBu, the expression vector of small interfering RNAs(siRNAs) targeting against caspase-3, a key effect component in apoptosis, also was constructed and transfected to rCHO cells producing human thrombopoietin(hTPO). Using this siRNA strategy, rCHO cells(F21 cells) expressing a low level of caspase-3 proenzyme determined by RT-RCR and Western blot analysis were established. Under the condition of 1-5 mM NaBu addition at the exponential growth phase, down-regulation of caspase-3 in F21 cells could not inhibit NaBu-induced apoptotic cell death. This apoptotic cell death occurred because F21 cells compensated for the lack of caspase-3 by increase of active caspase-7 level in the presence of NaBu. These results suggest that the intracellular caspase's interconnectivity should be taken into consideration for the succenssful inhibition of apoptosis of rCHO cells.
For the successful inhibition of apoptosis of rCHO cells, I down-regulated both caspase-3 and caspase-7 using the siRNA expression vector system. The rCHO cell line with reduced levels in both caspase-3 and caspase-7(FR26 cell) was developed and cultivated in serum-free medium containing NaBu. In the FR26 cell cultivation using NaBu, culture longevity was elongated and cell's survivability increased compared to control cell cultivations. However, on the contrary to the cultivation of R-bcl2-14 cells, the significant enhancement of hTPO concentration was not obtained in the cultivation of FR26 cells.
재조합 Chinese hamster ovary (CHO) 세포의 무혈성 부유배양에서 인간 혈소판 중식인자 (TPO)를 고농도로 생산하고자 기본 무혈청 배지에 효모 (yeast), 대두(soy), 밀의 글루텐(gluten), 쌀의 가수분해산물 (hydrolysate)을 각각 첨가하여 그들의 효과를 관찰하였다. 여러 가수분해산물 중에 yeast hydrolysate의 효과가 가장 뛰어났다. Yeast hydrolysate가 5 g/l로 첨가되었을 경우, 회분배양(batch culture)에서 최대 인간 TPO 생산 농도는 40.41μg/ml로, 이는 기본 무혈청 배지에서의 인간 TPO농도보다 무려 11.5배나 증가한 값이다. 이와 같은 인간 TPO 생산 향상은 yeast hydrolysate의 첨가에 의한 q값 (단위세포 당 생산속도)의 증가와 배양기간의 증가 때문이다. q값은 294%가 증가하였고, 세포생존율이 50%일때 배양을 끝낸다고 가정할 경우 배양기간은 2일 이상이 증가되었다. 또한, 세포생존율이 yeast hydrolystate 가 첨가된 배지에서 가장 높았으므로 죽은 세포로부터 흘러나오는 단백질 분해효소에 의한 인간 TPO의 분해가 최소화 될 수 있었다. 게다가, yeast hydrolyate의 첨가는 인가 TPO의 생물학적 활성을 그대로 유지시켰다. 따라서 이러한 결과들은 yeast hydrolysate가 제조합 CHO 세포의 무혈청 부유배양에서 인간 TPO 생산을 위한 효과적인 배지 첨가물임을 시사한다.
인간 TPO는 6개의 N-glycosylation과 24개의 O-glycosylation 당쇄를 가지고 있는 당쇄가 많이 붙어 있는 당단백질이다. Sodium butyrate가 재조합 CHO 세포에서의 인간 TPO의 생산과 quality에 미치는 영향을 연구하고자 O-10mM의 sodium butyrate를 대수성장기에 있는 세포에 처리를 하였다. Sodium butyrate의 첨가는 세포의 apoptosis를 일으켜 세포의 생존율을 감소시켰지만, 인간 TPO의 생산을 크게 향상시켰다. 최대 인간 TPO의 농도는 3 mM의 sodium butyrate을 첨가하였을 때 달성되었으며, 그 때의 인간 TPO 농도는 82.2μm/ml이었다. Sodium butyrate을 첨가하지 않은 배양과 비교해볼 때, 3mM의 sodium butyrate가 첨가된 배양에서 q값은 6.4배가 증가하였고 7일째 인간 TPO의 농도는 3.3가 증가되었다. 그러나, sodium butyrate는 인간 TPO의 quality를 저하시켰다. Sodium butyrate는 생산된 인간 TPO의 heterogeneity을 증가시켰고 acidic isoform과 sialic acid의 양을 감소 기켰으며 인간 TPO의 생물학적 활성을 또한 저하시켰다. 3mM의 sodium butyrate가 첨가된 배양에서 7일째 생산된 인간 TPO의 생물학적 활성은 sodium butyrate가 첨가되지 않은 배양에서 생산된 인간 TPO의 생물학적 활성의 72%이었다. 따라서 인간 TPO와 같이 당쇄가 많이 붙은 당단백질의 고농도 생산을 위해서 sodium butyrate을 사용하고자 할 때는 당단백질의 quality에 미치는 영향을 고려해야 할 것이다.
Sodium butyrate가 세포의 apoptosis을 유도하고 인간 TPO의 quality을 저하시키는 문제를 극복하고자 인간 TPO을 생산하는 재조합 CHO 세포에 apoptosis을 억제하는 단백질인 Bcl-2을 과발현하였다. Bcl-2가 과발현 되지 않는 대조군 세포 (R-neo)에 sodium butyrate을 첨가하지 않은 배양에 비하여, Bcl-2가 과발현 되는 세포 (R-bcl2-14)에 3 mM의 sodium butyrate을 첨가하여 배양하였을 때, 인간 TPO의 농도는 10배 이상 크게 증가하였다. Sodium butyrate에 의한 q값의 향상과 Bcl-2의 과발현에 의한 배양기간 연장이 인간 TPO의 농도 향상에 기여하였다. Sodium butyrate에 의한 인간 TPO의 quality 저하 문제는 Bcl-2의 과발현에 의해서 해결되지 않았다. 그러나 R-bcl-2-14 세포 배양에서 생물학적 활성이 높은 pl 3-5의 인간 TPO isoform의 양은 3mM sodium bytyrate 첨가로 단지 18%만 감소하였다. 결과적으로, R-bcl2-14 세포에 3mM sodium butyrate가 첨가된 배양에서 pI 3-5의 인간 TPO isoform 양이 6배 이상 증가하였다. 따라서, 무혈청 부유 배양에서 재조합 CHO 세포에서의 Bcl-2의 과발현과 sodium butyrate의 첨가는 인간 TPO와 같이 당쇠가 많이 붙은 단백질의 생산 향상에 효과적인 방법이 될 수 있다.
또한, sodium butyrate에 의한 apoptosis에 억제를 위해 RNA polymerase Ⅲ를 지닌 배터 시스템을 이용해 인간 TPO를 생산하는 재조합 CHO세포에서 caspase-3의 siRNAs을 발현시켰다. Caspase-3는 apoptosis를 일으키는 중요한 effector로서 caspase-3의 활성화는 apoptosis를 유도하여 세포를 죽인다. Engineered CHO 세포에서 caspase-3 siRNAs에 의하여 RT-PCR과 Western blot 분석에서 caspase-3의 mRNA와 단백질 양이 성공적으로 약 75% 가량 감소하였다. 그러나 예상과는 달리, caspase-3의 down-regulation은 sodium butyrate을 이용하나 배양에서 apoptosis에 의한 세포의 죽음과 세포생존율의 감소는 억제할 수 없었다. 흥미롭게도, caspase-3 siRNAs가 발현된 세포는 sodium butyrate가 첨가된 배양에서 caspase-3의 부족을 활성화된 caspase-7의 양의 증가로 보충하였다. Western blot 분석에서 engineered CHO 세포는 활성화된 caspase-3의 양이 감소되었으나, 활성화된 caspase-7의 양이 오히려 증가되었다. 이러한 결과는 재조합 CHO 세포에서의 성공적인 apoptosis 억제를 위해서는 세포내의 caspase들의 상호연관성을 고려해야 함을 제시한다.
성공적인 apoptosis의 억제를 위해서 siRNA 벡터 시스템을 이용하여 재조합 CHO 세포에서 caspase-3와 caspase-7 둘다를 down-regullation시켰다. Caspase-3와 caspase-7의 양이 감소된 CHO 세포 (FR26)가 개발되었으며, sodium butyrate가 첨가된 무혈청 배지에서 배양을 하여보았다. Sodium butyrate를 이용한 배양에서 FR26 세포는 배양기간을 연장시켰을 뿐만 아니라 sodium butyrate에 의해서 세포 생존율이 감소되는 문제를 효과적으로 극복시켰다. 그러나, Bcl-2가 과발현 되는 세포 (R-bcl2-14)와는 달리, FR26 세포에서의 인간 TPO의 생산은 크게 증대되지 않았다.
