N-Glycosylation of protein affects not only physical properties but also biological properties of protein, and it is important to evaluate the glycan structures of a glycoprotein. In this study, N-glycan structures of recombinant proteins, human transferrin (hTf), erythropoietin (EPO), and humanized antibody expressed in Gypsy moth and Chinese hamster ovary (CHO) cells were structurally analyzed with 2-D HPLC and MALDI-TOF MS.
First, N-glycan structures of recombinant hTf expressed by Gypsy moth cells were determined. Recombinant hTf was overexpressed and purified, and N-glycans were released from the purified recombinant human transferrin by glycoamidase-A digestion and derivatized with 2-aminopyridine, the glycan structures were analyzed by 2-D HPLC and MALDI-TOF MS. Structures of 11 glycans (88.8% of total N-glycans) were elucidated. The glycan analysis revealed that the most abundant glycans were $Man_{1-3}(±Fucα6)GlcNAc_2$ (75.5%) and $GlcNAcMan3(±Fucα6)GlcNAc_2$ (7.4%). There was only ~6% of high-mannose type glycans identified. Nearly half (49.8%) of the total N-glycans contained α1,6-fucosylation on the Asn-linked GlcNAc residue. However, α1,3-fucosylation on the same GlcNAc, often found in N-glycans produced by other insects and insect cells, was not detected.
Second, human α2,3-sialyltransferase (ST) and β1,4-galactosyltransferase (GT) were engineered into CHO cells which produce human EPO in order to enhance the sialylation of the protein. ST and GT are responsible for the terminal sialylation and galactosylation, respectively. Recombinant human EPO was purified from the culture supernatant of the engineered CHO cells by an immuno-affinity chromatography. N-Glycans were isolated after digestion with glycoamidase-F, and the sialylation of EPO was evaluated by HPLC. When the α2,3-ST was expressed in CHO cells (EC1-ST2), the sialylation of EPO glycans was significantly increased compared with that of control cells (EC1). In detail, the amounts of di-, tri-, and tetra- sialylated glycans were slightly increased while those of asialo- (neutral) and mono-sialylated glycans were decreased. Specially, the amount of tri-sialylated glycans was increased from 17.3 % to 26.1 %. When both α2,3-ST and β1,4-GT were coexpressed in CHO cells (EC1-GTST15), the sialylation was more increased than that of EC1-ST2. In case of EC1-GTST15 cells, the portion of tri-sialylated glycans was remarkably increased from 17.3% to 35.5%. This phenomenon was similar to the case of EC1-ST2 cells. The expressions of ST and GT in CHO cells did not affect both cell growth and EPO productivity. Thus, coexpression of α2,3-ST and β1,4-GT might be beneficial in CHO cells for producing a therapeutic glycoprotein with enhanced sialylation.
α2,3-ST was also overexpressed into recombinant CHO cells (SH-032) producing a humanized antibody against the S surface antigen of hepatitis B virus. The sialylation of antibody glycan was evaluated by DEAE-chromatography. Asialo- (neutral), mono-, and di-sialylated glycans were detected in the chromatogram. More than 70% of N-glycans was a neutral glycan. When the α2,3-ST was expressed in CHO cells (SH-ST11), total sialylation of antibody was slightly increased compared to that of the control cells (SH-0.32). Specially, the portion of di-sialylated glycans was increased while that of other glycans was proportionally decreased without the significant change of the amount of neutral glycans. The expression of α2,3-ST seemed to be partially effective to increase the sialylation of glycoproteins in CHO cells
생체내 당쇄합성과정(glycosylation)은 진핵세포 이상에서 발생하는 전사후과정으로서, 당단백질의 당쇄구조는 단백질의 물리적 성질뿐만 아니라, 효소활성, 생체내 반감기등의 생물학적 성질에도 큰 영향을 미친다. 본 연구에서는 집시나방 세포와 CHO 세포로부터 생산된 재조합 단백질(인간 트랜스페린, 에리쓰로포에틴, 치료용 항체)의 당쇄구조를 2-D HPLC와 MALDI-TOF MS를 이용하여 분석하였다. 집시나방 세포(Ld652Y)에서 생산된 재조합 인간 트랜스페린(hTf)을 분리하고 그 당쇄구조를 분석한 결과 인간 유래의 트랜스페린과 비교하여 불완전한 구조를 가지고 있었다. 특히 대부분의 당쇄구조가 $Man_{1-3}(±Fucα6)GlcNAc_2$ (75.5%)와 $GlcNAcMan3(±Fucα6)GlcNAc_2$ (7.4%)였다. 반면에 고만노오스 구조(high-mannose type)은 6%밖에 발견되지 않았다. 거의 절반 (49.8%)의 당쇄들이 α1,6-퓨코오스를 포함하고 있었다. 그러나 다른 곤충 및 곤충세포에서 자주 발견되는 α1,3-퓨코오스는 발견되지 않았다. 또한 세포 배양시 혈청을 첨가하였을 때 재조합 트랜스페린의 당쇄구조에 그다지 큰 영향을 나타내지 않았다.
당쇄말단의 시알산은 당단백질의 체내 반감기를 결정하는 중요한 요소이다. 당단백질의 시알산 당쇄함량의 증가를 목적으로 인간 에리쓰로포에틴(EPO)을 생산하는 재조합 CHO 세포(EC1)에 인간 시알산 전이효소 (human α2,3-sialyltransferase, α2,3-ST) 와 갈락토오스 전이효소 (human β1,4-galactosyltransferase, β1,4-GT) 를 과발현시켰다. 각각의 두 효소는 시알산 당쇄 합성과정에서 마지막에 작용하는 효소이다. 먼저 시알산 전이효소를 과발현하는 CHO 세포(EC1-ST2)를 구축하고 EPO의 시알산 당쇄구조를 분석하기 위하여 무혈청배지 배양조건에서 EPO를 분리, 정제하였다. 정제된 EPO로부터 당쇄(N-glycans)만을 분리한 후 형광표지 하여 DEAE-크로마토그래피를 이용하여 시알산 당쇄구조를 분석하였다. 대조군 세포(EC1)와 비교하여 α2,3-ST 를 과발현하는 EC1-ST2 세포에서 생산된 재조합 EPO는 더 많은 시알산이 붙어있는 당쇄를 가지고 있었다. 구체적으로, 시알산이 2개, 3개, 4개 붙어있는 당쇄의 양은 증가하였고, 시알산이 1개나 혹은 붙어 있지 않은(중성) 당쇄의 양은 감소하였다. 특히 3개의 시알산이 붙어있는 당쇄의 양이 상대적으로 많이 증가하였다(17.3% →26.1%). 다음단계로 시알산 전이효소와 갈락토오스 전이효소 (human β 1,4-galactosyltransferase, β1,4-GT) 를 동시에 발현시켰을 때, 생산되는 EPO의 시알산 당쇄구조를 분석하였다. EC1 세포에서 α2,3-ST 와 β1,4-GT를 모두 발현하는 세포주(EC1-GTST15)를 구축하였고, 무혈청 배지 배양조건에서 EPO를 생산하고 정제한 후, 앞서 동일한 방법으로 EPO의 시알산 당쇄구조를 분석하였다. 대조군 세포(EC1)와 비교하여 α2,3-ST와 β1,4-GT를 동시에 과발현하는 EC1-GTST15 세포에서 생산된 EPO에서 더 높은 수준의 시알산 당쇄들이 관찰되었다. α2,3-ST만을 발현하였을 때의 결과와 마찬가지로, 시알산이 3개 붙어있는 당쇄(tri-sialylated glycans)의 경우 17.3%에서 35.5%로 크게 증가함과 동시에 시알산이 붙어있지 않은 당쇄의 양도 21.4%에서 14.2%로 감소하였다. 하지만 4개의 시알산을 가지는 당쇄의 양은 큰 변화가 없었다. 당전이효소의 발현은 CHO 세포주의 세포성장 및 EPO 생산량에 영향을 주지 않았다. 결론적으로 두가지 당전이효소(ST와 GT)를 동시에 발현하였을 때 더 효과적인 것으로 밝혀졌다. CHO 세포에서 시알산 전이효소 및 갈락토오스 전이효소의 도입은 생산되는 당단백질의 시알산 당쇄구조를 향상시킬 수 있어 의약용 단백질 생산에 있어서 효과적인 방법으로 이용될 수 있다.
모델 당단백질을 바꾸어 인간화 항체(antibody)를 생산하는 CHO 세포(SH-0.32)에 α2,3-ST를 도입하여, 생산된 항체의 시알산 당쇄구조를 분석하였다. α2,3-ST가 발현되는 CHO 세포(SH-ST11)를 구축하고 무혈청 배지 배양조건에서 각각의 CHO 세포에서 항체를 생산하고 분리, 정제한 후 시알산 당쇄구조를 분석하였다. 대조군 세포(SH-0.32)와 비교하여 α2,3-ST만을 발현하는 SH-ST11 세포에서 생산된 재조합 항체에서 일부 증가된 시알산함량이 관찰되었다. 구체적으로 시알산이 2개 붙어있는 당쇄(di-sialylated)의 양은 증가하였고, 시알산이 1개 붙어 있는 당쇄(mono-sialylated)의 양은 감소하였다. 그러나, 대부분의 당쇄가 시알산이 붙어 있지 않은 중성당쇄(>70%)였고 그 양은 대조군과 비교하여 크게 변화하지 않았다.
