본 연구에서는 마이크로미터 크기의 생물학적 리간드 (biological ligand) 및 세포 패턴을 형성하기 위하여 소프트리소그래피 (soft Lithography) 방법을 이용하였다. 소프트리소그래피에는 여러 방법이 있으나, 본 연구에서는 주로 마이크로컨텍 프린팅 (microcontact printing, uCP) 방법을 이용하였다. 마이크로컨텍 프린팅은 도장 (stamp)에 잉크를 묻혀 stamping하는 방법으로, poly(dimethoxysiloxane) (PDMS) 로 제작된 도장에 유기분자 (잉크)를 묻혀, 작용기 (reactive group)가 도입된 기판표면 위에 stamping 하면, 유기분자와 기판표면에 도입된 작용기와의 화학적 결합을 통하여 자기조립 단일막 (self-assembled monolayer, SAMs)을 형성하게 되고, 이렇게 형성된 자기조립 단일막을 이용하여 다양한 분야의 연구를 수행할 수 있다.
본 연구에서는, 여러가지 기판표면 (실리콘, 폴리스타이렌, 유리 등) 위에 작용기를 도입하기 위하여 비닐기 (vinyl group)을 말단으로 하는 5-hexenyl trichlorosilane 을 사용하여 자기조립 단일막을 형성하였다. 형성된 비닐기는 과망간산 칼륨을 사용, 산화시켜 카르복시기로 전환 후 이를 활성화시키기 위하여trifluorocaetic anhydride 와 triethlyamine 으로 처리하여 interchain anhydride 를 형성하거나, Pentafluorophenol (PFP) (or N-hydroxysuccinimide, NHS)과 1-ethyl-3-(di-methyl- amino)Propylcarbo-diimide (EDC)로 처리하여 PFP (or NHS)로 활성화된 기판표면을 만들어 주었다. 이렇게 활성화된 기판표면은 마이크로컨텍 프린팅 시 사용되는 유기분자 내 아민기와의 아마이드 결합을 통하여 마이크로 크기의 자기조립단일막을 쉽게 형성할 수 있었다.
먼저, 마이크로컨텍 프린팅 방법을 이용한 실리콘 패턴형성에 대한 연구내용을 살펴보면, 실리콘 기판표면 위에 앞에서 언급한 방법 중 interchain anhydride 를 형성하여 준 후, po1y(ethylene imine) (PEI)를 컨텍 프린팅하여 PEI 마이크로 패턴을 형성하였다. 이렇게 형성된 PEI 마이크로 패턴은 수산화칼륨 용액 내에서 실리콘을 식각 (etching) 시 저항면 (resistant layer)으로 사용되어, PEI 마이크로 패턴이 형성되지 않은 부분만 식각되어 우리가 원하는 실리콘 마이크로 패턴을 형성할 수 있었다. 또한, 폴리스타이렌 페트리디쉬 (Petri dish) 표면 위에 마이크로 세포 패턴을 형성하기 위하여 interchain anhydride 가 형성된 기판표면 위에 undecylamine 을 컨텍 프린팅 하여준 후, po1y(ethy1ene glycol)을 back-filling 하여 소수성 마이크로패턴을 형성하여 주었다. 이렇게 형성된 소수성 마이크로 패턴 위에 살아있는 세포를도포하여 주면, 세포 친화력이 있는 소수성 패턴 표면을 따라 세포가 성장하게 되어 마이크로 세포 패턴을 형성할 수 있었다.
다음으로, 생분해성 (biodegradable) 고분자로 널리 알려져 있는 po1y(g1yco1icacid) (PGA)를 이용한 표면 기능화 (surface functionalizaton) 및 세포 패턴형성 연구에 대한 내용을 살펴보면 다음과 같다. 폴리에스터 계열의 생분해성 고분자들은 수산화이온의 영향을 받아 주사슬을 구성하는 에스터 결합이 깨져 카르복시기와 수산화기로 가수분해된다. 따라서, 본 연구에서는 PGA 고분자로 형성된 봉합사 및 필름을 수산화 칼룸 용액으로 처리, PGA 고분자 표면을 가수분해 시켜 카르복시기를 형성할 수 있었다. 이렇게 형성된 카르복시기를 PFP (or NHS)와 EDC 로 처리하여 활성화 시킨 후 바이오틴-아민과 결합시켜 생물학적 활성을 갖는 PGA 봉합사를 제조할 수 있었으며, PGA 필름인 경우 바이오틴-아민을 컨텍 프린팅하여 고분자 표면에 바이소틴 마이크로 패턴을 형성할 수 있었다. 또한, PGA 고분자 필름 표면에 세포 패턴을 형성하기 위하여 RGD 를 포함하는 펩타이드 마이크로 패턴을 형성하여 준 후, 세포를 도포, 배양시켜 줌으로서 생분해성 고분자 필름 표면 위에 세포 패턴을 형성할 수 있었다.
포자 (spore) 또는 영양세포 (vegetative cell)의 마이크로 패턴형성에 대한 연구를 살펴 보자. 유리기판 위에 interchain anhydride 를 형성시키고 아민기를 말단으로 하는 바이오틴 (biotin-amie)을 컨텍 프린팅하여 생물학적 리간드 패턴을 형성하여 주었다. 이렇게 형성된 바이오틴 패턴 위에 streptavidin 을 도포하여 생물학적 활성을 가지는 표면으로 전환하여 주었다. 일반적으로 streptavidin 은 biotin 네 분자와 생물학적 결합을 형성할 수 있어, 유리기판 표면에 존재하는 바이오틴 뿐만 아니라 다음에 도포 되는 바이오틴과의 생물학적 결합을 기대할 수 있다. 포자 표면에 생물학적 리간드인 바이오틴을 형성하기 위하여 녹색형광단백질 (enhanced greenfluorescence protein, EGFP)을 발현 (expression) 시켜준 후, EGFP-항체, 바이오틴-단백질-A (biotin-protein-A)을 차례로 접합하여 주었다. 따라서, 표면에 바이오틴을 포함하는 포자를 streptavidin 마이크로 패턴이 형성된 유리기판 위에 도포 하여 줌으로서 생물학적 결합으로 포자패턴을 형성할 수 있었다. 또한, 유리기판 위에 형성된 포자 마이크로 패턴을 배양시켜 줌으로서 포자가 발아 (germination)되어 영양세포 패턴을 형성할 수 있었다.
