SUMOylation, the process of conjugating small ubiquitin-like modifier (SUMO) to a target protein, is one of typical post translational modifications of proteins in eukaryotic cells and mediated by multiple enzymes. We developed a chip-based assay of SUMO conjugation by employing a domain protein of RanGAP1 as a target substrate. The relevant protein components to SUMOylation including E1 (SAE1/SAE2), E2 (Ubc9), and SUMO protein were expressed in E. coli and purified to homogeneity. To examine the selectivity of SUMO conjugation, the RanGAP1 domain with a single mutation (K526A) was also tested. Target substrate was immobilized on a surface-mo ified glass slide followed by addition of the reaction mixture for SUMOylation, and SUMO conjugation was detected using dye-labeled antibodies. For reliable and sensitive detection of on-chip SUMOylation, the reaction conditions were optimized with respect to the concentrations of protein components, the composition and the reducing state of the reaction mixture for SUMOylation, and the concentrations of dye-labeled antibodies. Under established conditions, the on-chip SUMOylation of RanGAP1 domain resulted in at least 7-fold higher fluorescence intensity than that of its mutant (K526A) irrelevant to SUMO conjugation. The on-chip SUMOylation was validated and quantified by using surface plasmon resonance spectroscopy. The chip-based assay developed here seems to provide a strategy enabling a high throughput analysis of SUMO conjugation.
수모일레이션 현상은 단백질 합성 후 변형과정 중의 하나로 다양한 세포의 기능을 조절한다는 관점에서 중요한 생체 활동이다. 본 연구에서는 여러 효소에 의한 수모일레이션 현상을 단백질 칩과 결합시키는 접근 방법을 시도하였다. 이를 위해 수모일레이션에 관여하는 여러 효소들은 모두 E. coli에서 발현하여 정제하였고, 수모 단백질과 결합하는 RanGAP1 domain 단백질을 유리 표면에 고정화하였으며 수모일레이션된 단백질을 검출하기 위하여 Cyaninedye 결합 항체를 이용하여 분석하였다.
수모일레이션에 의해 수모 단백질과 공유결합 하는 관련 단백질을 선택적으로 찾아내고, 비특이적인 단백질의 결합을 최소화하기 위하여 항체의 농도, 수모일레이션에 관여하는 효소들의 농도, DTT에 의한 용액의 조성 등의 반응 조건이 최적화 되었다. 단백질 칩 상에서, 이러한 방법을 통해 최적화된 조건을 이용하여 관련 단백질의 수모일레이션의 형광 intensity 는 관련 없는 단백질(mutant(K526A) of RanGAP1 domain, BSA) 보다 7배 높은 수준까지 검출 할 수 있었다. 단백질 칩 상에서의 수모일레이션은 SPR spetroscopy를 이용한 정량적 분석으로 확인되었다.
또한 microarray 형태의 수모일레이션의 분석을 통하여 여러 다양한 단백질 사이에서 수모일레이션되는 관련 단백질을 신속하고 광범위하게 검출해 내는 단백질 칩의 가능성을 제시하였다.
