The activity and stability of xylanases from Bacillus sp. were improved by directed evolution. Two mutants (D3 and D9) were selected by sequential rounds of error-prone PCR to introduce random mutations and membrane-based screening of the resultant mutant library. Both D3 and D9 had four amino acid substitutions. Two mutants (M32 and M32D9) was constructed by site-directed mutagenesis. They had six and seven amino acid substitutions respectively. All the substituted amino acids were located on the surface of protein and some substituted amino acids had non-polar residues with hydroxyl group.
The activity and stability of four mutants (D3, D9, M32, and M32D9) were enhanced in alkaline conditions, compared to that of wild type. Especially M32D9 had 4-fold higher enzyme activity than the wild-type enzyme at pH 9.0. It also displayed increased alkalostability. It maintained about 89% of its initial activity even after incubation for 18 days, whereas the wild-type enzyme lost 50% of its activity after 6 days at pH 9.0. In addition to alkalostability, thermostability was also improved in D3, D9, and M32D9.
Mutant xylanase (M161) was expressed using recombinant Bacillus subtilis harboring pSMX-M161 vector. In semi-defined medium containing 20 g/l of glucose and 3 g/l ammonium sulfate, 11.7 U/ml and 38 U/ml of xylanase activity were obtained in 18 hours of batch cultivation and 22 hours of fed batch cultivation respectively.
1. 본 연구에 이용된 membrane-based screening 방법과 96 Well-Deep Plate를 이용한 방법은 alkaline 조건에서 높은 활성과 안정성을 동시에 갖는 mutant xylanase를 선별하는데 쉽고 효율적인 유용한 방법이었다.
2. Screening에 의해 선별된 D3와 D9의 활성은 alkaline 조건에서 wild type xylanase의 활성에 비해 모두 증가되었다. 또한 두 mutant 모두 pH 4.0-10.0 구간에서 wild type 보다 높은 활성을 보였으며, alkalostability도 크게 증가되어 alkaline 조건 (pH 9.0)에서 18일 동안 incubation 한 후에도 초기 활성의 80% 이상을 유지 하였다.
3. Site-directed mutagenesis에 의해 구축된 M32와 M32D9은 alkaline 조건에서 높은 활성과 안정성을 나타내어 wild type xylanase의 활성에 비해 4배 이상 높은 활성을 보였다. M32는 alkaline 조건 (pH 9.0)에서 18일 동안 incubation 한 후에도 초기 활성의 90% 정도의 잔여 활성을 유지하였고, M32D9은 최적 pH가 6.0 으로 wild type xylanase의 최적 pH 5.5 에 비해 증가되었다.
4. 선별된 mutant xylanase (D3, D9, and M32D9)은 내알칼리성 뿐만 아니라 열 안정성도 크게 향상되었다. 특히 M32D9은 wild type에 비해 반감기가 2배 이상 증가되었고 최적 온도도 60℃로 wild type xylanase의 최적 온도 55℃에 비해 증가되었다.
5. Mutant xylanase M161을 20 g/l glucose, 3 g/l ammonium sulfate를 각기 탄소원과 질소원으로 이용한 semi defined medium을 이용하여 30℃, pH 7.0에서 18시간동안 회분식 배양한 결과 2.5 g/l의 건조 균체 질량과 11.7 U/ml의 xylanase 생산을 얻었다. 같은 조건에서 pH STAT 방법으로 22시간 동안 유가식 배양을 한 결과 13.5 g/l 의 건조 균체 질량을 얻었고, 38 U/ml의 xylanase 생산을 얻을 수 있었다.
