We report a multiplex analysis approach using mass-tagged extension primers in single base extension for genotyping of single nucleotide polymorphism (SNP). In this method, oligonucleotide primers that are specific to polymorphic sites in the DNA template are simultaneously extended with each biotin-ddNTP by DNA polymerase to generate 3’-biotinylated DNA products in each four tube. These products in each tube are captured by streptoavidin-coated magnetic beads while unextended primers and other components are washed away. These captured extended primers which have one deoxyuridine sequence between 5’-mass-tag region and 3’-template recognition region are cut by uracil-DNA glycosylase to generate liberal oligonucleotides that have distinct mass according to specific SNP sites. The liberal oligonucleotides which code specific SNP sites in each tube are identified by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). We successfully analyzed 50 SNP loci at the same time.
본 연구는 서로 다른 질량을 가짐으로써 표지 역할을 수행하는 DNA 조각을 이용하며, 유전자 복제 반응 종결자(ddNTP)를 이용한 단일 염기 연장법(single base extension; SBE)과 MALDI-TOF 질량분석기 분석에 기초한 유전자 단일염기다형성(SNP) 분석방법 개발에 관한 것이다. SBE와 질량분석기를 이용한 기존의 분석 방법은 SBE반응 산물인 연장된 extension primer의 질량을 분석하여 연장 여부를 판별하였다. 경제적인 면에서 이점이 많은, 여러 SNP를 동시에 분석하는 multiplex SNP genotyping 방법을 이용하기 위해서는 이 extension primer의 서열을 조절하여 여러 primer간에 질량이 겹치지 않도록 해야 하는데, 이는 SBE반응에 중요한 역할을 하는 primer를 직접 조절하는 방법이므로 많은 제약이 따른다.
본 분석 방법은 주형 DNA에 대해 상보적인 염기 이외에는 SBE반응에 참여하지 못함을 이용하여, 여러 종의 extension primer 혼합물과 biotin 구조를 포함하는 각각의 네 가지 ddNTP를 한가지씩만 반응 용기에 넣고 SBE반응을 수행한 후, biotin과 친화력을 가지는 streptavidin이 부착된 자석입자를 이용하여 반응이 된 extension primer만을 분리해 내는 방법을 포함한다. 이 때 반응에 참여하는 DNA oligomer는 SBE 반응에 관여하지 않는 5’ 말단에 질량 표지 역할을 수행하는 DNA 조각을 포함하며, 그 조각이 uracil-DNA glycosylase를 사용하여 절단될 수 있도록 deoxyuridine에 의해 연결되어 있다. Streptavidin 자석입자에 의해 정제된 DNA oligomer를 uracil-DNA glycosylase와 반응하여 질량표지를 떼어낸 후, 이를 MALDI-TOF 질량분석기를 사용하여 그 질량을 분석함으로써, 한명의 환자 DNA에 존재하는 SNP 여러 개를 동시에 분석할 수 있다. 본 연구에서는 50 군데의 SNP를 동시에 성공적으로 분석하였다.
