The increasing needs for therapeutic proteins derived from mammalian cells such as recombinant antibody has led to many developments in the area of animal cell technology. In this study, physiological and cultural characteristics of recombinant CHO cells for the production of recombinant antibody was investigated and applied to bioreactor systems for the development of the high productive culture of recombinant production mainly focused on depth filter perfusion culture.
In hyper-osmotic condition, Cell growth was inhibited, otherwise, specific productivities was increased. Cellular growth rate and cell density integral was increased, otherwise, specific productivities were decreased, when Glycine betaine was added. In DFPS, near 400 mOsm/kg, no significant harmful inhibition and antibody productivity decrease was occurred for future fortified medium design.
Addition of Sodium butyrate (1,2,4,8 mM) had a severe cytotoxicity on rCHO cells. However, Specific Productivity was increased sharply. In the aspect of perfusion culture for higher productivity, Addition of sodium butyrate may lead unstable operation of long term culture. Change of culture temperature had an effect on cell growth, longevity, and productivity. For temperature strategies for high productivity, first, temperature shift from 37 ℃ to 33 ℃ at 120 hour from innoculm was 28% higher antibody concentration than that of 37 ℃ stable control experiment. Second, temperature oscillation between 37 ℃ and 33 ℃ for a day and for other day could get 47%, 39% higher antibody concentration than that of 37 ℃ stable control experiment, respectively. Medium component screening for enriched medium development showed several candidates for $rCHO CS^*13-1.00$.
The $rCHO 26^*-320$ cells were successfully cultivated in a depth filter perfusion system, showing high cell density, high antibody production rate, and stable long-term culture. In the DFPS, the volumetric productivities were 43 and 53 times higher than that from stirred tank reactor when the perfusion rates were 5 /d and 6 /d, respectively. In 2-stage DFPS by $rCHO 26^*-320$, the productivity were 92% higher than that of single stage DFPS. Moreover, was 102 times higher than that from stirred tank reactor respectively.
The $rCHO CS13^*-1.00$ cells were successfully cultivated in a depth filter perfusion system for a long time, showing high cell density, high antibody production rate (367.42 mg/d), and stable long-term culture for over 1900 hours. In 2-stage DFPS by $rCHO 26^*-320$, the productivity were 92% higher than that of single stage DFPS. On 33 ℃ operation in 2nd stage DFPS, productivity was 24% higher than that of 2nd stage DFPS with 37 ℃. In DFPS, Operation in 30 ℃ and 33 ℃ showed positive effects on productivity. Temperature oscillation strategies with two times in a day, every day, every other day between 33 ℃ and 37 ℃, didn’t show significant effects in comparison with batch culture due to continuous principle. In DFPS, when pH decreased, glucose uptake rate decreased but, product yield coefficent from glucose and lactate yield coefficient from glucose increased. When D.O. level and Medium circulation rate increased in depth filter matrix, productivity increased, the product yield coefficient from glucose also increased. This study suggested optimization and high-productive strategies for recombinant antibody by rCHO cells in bioreactor systems.
재조합 CHO 세포배양을 통하여 재조합 항체의 생산법을 개발 하기위하여, 다양한 재조합 CHO 세포주들을 사용하여, 항체생산성향상을 위한, 세포 생리적 환경적 인자에 대한 연구를 수행하여 생물반응기시스템에 적용하고자 하였다. 삼투압에 대한 항체생산성 연구를 통하여 삼투압이 증가됨에 따라, 항체의 생산성이 증가됨을 알수 있었으나, 세포의 성장의 저해를 나타나, 삼투압 보호제를 사용하여, 세포의 성장을 증가시키려고 하였고, 세포의 성장은 증가되었으나, 항체생산성의 감소로 나타났다. 이러한 고삼투압에 대한 항체 생산성은 강화배지 개발에 있어서, 다양한 형태로 응용 될수 있으며, 퍼퓨젼배양에서 400 mOsm/kg 에서는 별다른 성장의 감소를 가 나타나지 않았다. 부티릭산을 사용하여 항체생산성 향상을 꾀하고자 하였으나, 고려된 농도내에서 상당한 성장저해를 받아 고농도 세포배양을 위한 항체생산성 증가로 고려하기 힘들었다. 다음은 온도를 저하시킴으로 인하여, 항체생산성과 세포지속성에 대한 연구를 수행하였다. 온도를 저하시킴으로 항체생산성이 증가되었으나 세포의 성장은 둔화되거나 저해를 받았다. 그리하여, 다양한 실험을 통하여, 회분식 배양에서 온도를 37도에서 33도로 매일 변화시킴과 회분식 배양에서 온도를 변화시키는 시점을 조절함으로 인하여, 항체의 생산성을 증가시킬수 있었다.
다음으로 다양한 배지성분을 강화하여 실험하여, 강화가능한 후보군을 선정하였다. 이를 통하여, 생물반응기 조업을 실시 하였다. 회분식, 연속식 및 고농도 배양을 다양한 세포주를 이용하여 생물반응기를 이용한 다양한 조업에 대한 비교를 실시하였으며, 특히 2단 깊이필터를 이용한 고농도 배양을 통하여, 회분식 생물 배양기 조업에 비하여 수십배이상의 항체생산성을 증가 시킬 수있었다. 또한 2단 배양기의 온도저하를 통하여 일반 2단 퍼퓨젼 배양에 비하여 24%정도 생산성을 향상시킬수 있었다. 또한 깊이필터 부분의 유량속도 와 용존산소농도를 측정하여 깊이필터에서의 적절한 산소공급을 위한 유량속도와 용존 산소농도를 제시 할 수 있었다. 또한 단일 깊이필터를 이용한 퍼퓨젼 배양을 통하여, 온도, 삼투압, pH, 용존산소 에 대한 배양환경의 변화를 고찰하여, 최적화를 위한 정보를 얻을 수 있었다.
이를 통하여, 일반 회분식 생물반응기에 비하여 수십배 이상의 생산성을 확보할 수 있는 생산시스템을 제시 하였다.
