In this paper, a new electrochemical enzyme immunoassay technique for sensing antibody-antigen interaction has been developed. The gold electrode was covered with the mixed SAMs of mercaptododecanoic acid (MDA) and mercaptoundecanol (MUO) and then partially ferrocenyl-tethered dendrimer (Fc-D) was covalently immobilized to the electrode surface using 1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide (EDC)/N-hydroxy succinimide (NHS) coupling. The Fc-D acts not only as a building block but also as a electron transfer mediator. As a building block, the remaining amines of immobilized Fc-D are able to be modified with biotin groups, and its ferrocene part acts as an electrocatalyst to enhance the electrochemical signals. The biospecific recognition of alkaline phosphatase conjugated anti-biotin antibody to biotin-functionalized surface results in converting the electrochemical inactive substrates to electroactive products by enzymatic reaction. The electroactive enzymatic products lead to the electrocatalytic reaction of ferrocene. The electroactive enzymatic products are electrocatalytically oxidized by the electronic mediation of ferrocene. The relationship between this enhanced signal and concentration of anti-biotin antibody is investigated. To characterize this mechanism, we carried out cyclic voltammetry (CV) and surface plasmon resonance (SPR) experiments.
최근 의학과 생화학 분야에서는 종전의 분석법보다 더 감도가 좋으며, 대량의 정보를 한번에 간단하게 처리할 수 있는 칩 기반의 바이오센서에 대한 연구가 매우 활발하다. 이러한 최근의 흐름에 발맞추어 우리는 이번 연구에서 항원-항체 사이의 상호 특이적인 인식을 전기화학적으로 검출할 수 있는 방법에 관한 연구를 수행하였다.
금 전극위에 MDA, MUO를 이용해서 자기 조립 단분자층을 형성하고, 이 위에 부분적으로 페로센 치환된 덴드리머(dendrimer)를 DEC/NHS coupling을 이용하여 고정하였다. 이렇게 만들어진 표면 개질된 금 전극은 항원의 고정과, 전기화학 반응에 대한 전자전달 매개체로 이용된다. 그 후에 항원인 biotin을 EDC/NHS counping 으로 덴드리머 위에 고정시키면 항체를 검출할 수 있는 전극이 완성된다. 이후에 Alkaline phosphatase (ALP) 가 연결된 항체를 넣어서 항원과 항체사이에 상호특이적인 인식이 일어나도록 하였다.
항원 항체 특이적인 반응의 인식은 ALP를 라벨로 한 전기화학적 방법으로 측정될 수 있다. ALP는 ρ-APP라는 효소 기질을 효소반응을 통해서 ρ-AP라는 산화 환원 반응이 가능한 물질로 변화시킨다. 이 물질은 표면 개질된 전극에 있는 페로센에 전자를 전달하여 전기촉매 전류가 흐르게 한다.
산화 환원 측정 순환 전압전류법 (CV)과 Surface Plasmon Resonance (SPR)로 측정한 결과 항체가 없거나, 항체를 avidin이라는 단백질로 둘러싸서 항원 항체 인식을 막았을 경우에는 전기촉매 전류가 흐르지 않았다. 각각의 경우에 신호 대 잡음 비율 (S/N)은 항체가 없는 경우 10.8 , 항체를 막아버릴 경우 13.0 이 나왔다. 이는 항원 항체 특이성을 구별하기에 충분히 큰 값이다.
또한 정량적인 실험결과 약 1㎍/mL 의 농도의 항체로 매우 큰 신호로 측정이 가능하였다. 이것은 이 방법의 측정 감도가 매우 좋다는 것을 보여준다.
이러한 새로운 항원 항체 인식에 대한 전기화학적 측정법은 앞으로 biotechnology분야에서 크게 이용될 것이다.
