A male sterile mutant, lcas(Leaf Curling to Abaxial Side) with a defect in anther dehiscence was identified in Arabidopsis thaliana population, mutagenized with T-DNA insertion. Anther dehiscence in mutant`s anther is not taken placed after flowering in compare with wild type Col-0 plant, but mechanical force can release the mature pollen which can fertilize mutant`s itself and fertilized eggs show normal growth but slightly retarded maturation in compared with that of wild type.
This mutation is tagged by T-DNA harboring BAR gene which confers resistance to BASTA(main gradient is phoshinothricin), a herbicide, and the segregation ratio of mutant phenotype to wild type is 1(mutant 189): 3(wild type 608), and all mutants show Basta resistance, so this mutation is recessive . The causative gene is cloned by TAIL-PCR method and this gene`s expression is disappeared in mutant background. Full genomic fragment, encompassing LCAS gene`s promoter, coding region and terminator could complemented the mutant phenotype, but mutated form of genomic fragment failed in rescue. LCAS is predicted to encodes an nuclear metal binding protein. In transient particle bombarding assay, GUS::LCAS protein is localized in nucleus of onion epidermis cell, and in divalent metal ion charged affinity column test, GST::LCAS proteins have copper ion affinity but mutated form of GST::mLCAS lost it`s affinity to copper ion. therefore LCAS is a nuclear copper binding protein which is required for normal anther dehiscence. It`s expression was detected mainly in Pistil, vascular bundle and inner connective tissue of anther, phloem of leaf and root and stem in LCAS::GUS transgenic plant.
LCAS`s expression is repressed by CuSO4, and in mutant`s background, Myb26is up-regulated in compare with that of wild type. This mutant shows greatly retarded growth, increased branching, leaf curling, early termination of flower bud formation and triple cauline leaves. In mutant and over expressor`s background, mitochondria, chloroplast, nucleus localized catalytic gene`s expression profile was severely changed in microarray analysis. LCAS interacting protein, LIF play an antagonistic role in leaf curvature.
잎이 아래쪽으로 구부러지는 수술에서 화분 방출이 이루어지지 않아 남성불임을 일으키는 돌연변이인 lcas를 T-DNA로 돌연 변이된 애기 장대 집단에서 분리하였다. 돌연변이의 수술에서는 정상적인 자연 형과 비교하여 꽃이 만개한 후에도 수술에서 화분이 방출되지 않았지만, 물리적인 압력을 가하면 돌연변이의 암술은 물론 자연형의 암술까지도 수정시킬 수 있는 능력을 가지는 화분을 방출하였으나, 자신의 암술에 강제적으로 수정을 하였을 때는 자연형의 암술과 교배한 배아 체보다 그 성숙 속도가 느렸다. 돌연변이는 전체적으로 자연 형과 비교해서 그 발육이 느리고 가지수가 증가했으며, 무한화서인 애기장대 자연 형과는 달리 꽃대의 형성이 조기에 중지되었으며, 측엽 세장이 동시에 생성되는 경우도 관찰되었다.
자스몬 산은 식물체내에서 병원균에 의해서 그 생합성이 유도되는 비전형적인 식물호르몬인데, 이 호르몬의 부족은 수술의 화분 열개에 문제를 일으켜서 남성 불임을 유도한다. 하지면 이 돌연변이체는 자스몬 산의 처리에 남성불임이 회복되지는 않았다.
이 돌연변이체는 T-DNA내에 제초제인 바스타에 저항성 유전자를 가지고 있으며, 이 돌연변이 형질은 바스타 저항성과 함께 유전되는 것으로 조사되었고 열성유전으로 밝혀졌다.
돌연변이 원인 유전자는 TAIL-PCR 방법으로 클로닝 하였으며, 이 유전자는 돌연변이체에서 발현이 사라졌다. LCAS의 전체 유전자 조각을 돌연변이에 넣을 때에는 돌연변이를 다시 자연형으로 돌리는 데 성공하였으며, 이 유전자의 금속 부착 부위를 돌연변이 시킨 조각을 넣을 때에는 자연 형으로 돌리는 데는 실패하였다. 이로써 애기 장대의 5번 염색체의 유전자 번호 23760이 이 돌연변이의 원인 유전자임이 명백해졌다. LCAS 유전자는 핵 속에 위치한 금속부착 단백질을 가진 것으로 예측되었다. 양파 표피 세포에다가 금 입자를 쏘았을 때에 GUS::LCAS 단백질이 핵에 위치하는 것을 관찰할 수 있었으며, 금속 친화 컬럼에서, GST::LCAS 단백질은 구리 이온과 친화력이 있는 것으로 밝혀졌다.
이 단백질의 발현은 주로 수술대, 수술의 안쪽의 연결조직, 통도조직, 잎이나 뿌리의 체관에 주로 발현되는 것으로 LCAS::GUS 형질전환 체에서 관찰되었다. LCAS의 발현은 10μM 이상의 CuSO4 처리에 의해서 억제되는 것으로 조사되었으며, 자스몬에 의해서는 발현이 유도되지는 않는 것으로 조사되었다. 이제 막 꽃이 피기 시작한 돌연변이의 꽃에서는 자연 형에서 보다 Myb26의 발현이 증가되어있는 것으로 조사되었다. 돌연변이에서는 주로 엽록체, 미토콘드리아, 핵의 catalytic 과정에 관여하는 유전자들의 발현이 많이 변하였다. LCAS와 상호작용하는 단백질인 LIF는 LCAS와는 반대로 입의 모양을 변화시키는 것으로 조사되었다.
