Characterization of the basic transcription machinery of human mitochondrial DNA is of fundamental biological interest and may also lead to therapeutic interventions for human diseases associated with mitochondrial dysfunction. Recently it was reported that two forms of a transcription factor (TFB1M, TFB2M) have been identified as the missing components of the transcription initiation machinery for human mitochondrial DNA. We cloned the genes encoding TFB1M and TFB2M from a human cDNA library by polymerase chain reactions (PCR) and subcloned them into an expression vector. The genes were expressed in Escherichia coli (E.coli) and the proteins were purified by affinity chromatography. These, together with the transcription factor A (TFAM) and mitochondrial RNA polymerase (POLRMT), constitute the complete transcription initiation machinery in human mitochondria. The reconstituted system will be used to study the control of mitochondrial transcription and DNA replication.
인체 미토콘드리아 DNA의 전사 기작을 규명하는 것은 생물학적 진리 추구인 동시에 미토콘드리아의 이상에 의한 질병의 치료를 가능하게 할 것이다. 최근, 미토콘드리아 DNA 의 전사 시작에 관여하는 전사 인자 TFB1M과 TFB2M이 밝혀졌다. 그래서 TFB1M과 TFB2M의 유전자를 human cDNA library에서 Polymerase chain reaction을 통해 증폭하여 pQE-60 expression vector에 넣었고 pQE-60-C_6Xhis_TFB2M으로 명명하였다. 이것은 signal peptide DNA 서열을 뺀 TFB2M DNA 서열에 C-terminal 에는 histidine tag을 붙인 것이다.. pQE-60-C_6Xhis_TFB2M를 대장균에서 발현시켜, $Ni^{2+}-nitrilotriacetic$ acid (NTA) 크로마토그래피를 통해 정제 하였다. 정제된 C_6XHis_TFB2M는 다시 heparin 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 또한 미토콘드리아 RNA 중합효소인 POLRMT의 안정성을 높이기 위해 C_6Xhis_TFB2M과 POLRMT를 같이 발현시켰으나, POLRMT 발현되지 않고, 소량의 C_6Xhis_TFB2M만 정제되었다. 클로닝에 성공한 C_6Xhis_TFB2M 은 TFAM과 미토콘드리아 RNA 중합효소와 함께 인체 미토콘드리아 전사 개시를 시험관 내에서 재현하는 것에 쓰일 것이다. 이 재현 시스템은 미토콘드리아 전사와 DNA 복제의 조절을 연구하는데 사용될 것이다.
