Comparison of various plant samples at the metabolome level using pattern recognition analysis of analytical spectra (pyrolysis mass spectrometry, fourier transform infrared spectroscopy, and proton nuclear magnetic resonance spectroscopy) was achieved. Pyrolysis mass spectrometry (PyMS) is a rapid, simple, high-resolution analytical method based on thermal degradation of complex material in a vacuum and has been widely applied to the discrimination of closely related microbial strains. Also fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) provides biochemical profiles containing overlapping signals from a majority of the compounds present when whole cells are analyzed. Leaf samples of seven higher plant species and varieties were subjected to PyMS and FTIR. Principal component analysis (PCA) of PyMS data was not able to discriminate these plants in discrete clusters. However, canonical variate analysis of PyMS data separated these plants from one another. A hierarchical dendrogram based on canonical variate analysis was in agreement with the known taxonomy of the plants at the variety level. These results indicate that PyMS is able to discriminate higher plants based on taxonomic classification at the family, genus, species, and variety level. Like PyMS, a hierarchical dendrogram based on PCA of FTIR data showed relationships between plants that was in agreement with known plant taxonomy. Genetic programming analysis determined the top three to five biomarkers from FTIR data that discriminated plants at each hierarchical level of the dendrogram. Most biomarkers determined by GP analysis at each hierarchical level were specific to the carbohydrate fingerprint region ($1200-800cm^{-1}$) of the FTIR spectrum. Differences in cell wall composition and structure can provide the basis for chemotaxonomy of higher plants as our results indicate that discrimination of higher plant species and varieties by FTIR reflects the known phylogenetic relationships between plants.
To determine whether pattern recognition based on biochemical profiles for whole cells of higher plants is able to discriminate plants genetically, leaf samples of eight cultivars of Catharanthus roseus were subjected to FTIR and proton nuclear magnetic resonance spectroscopy ($^1H$ NMR). Hierarchical dendrograms based on principal component analysis of the FTIR fingerprint region data and the NMR aliphatic and aromatic region data exhibited possible relationships between cultivars, which were in general agreement with genetic discrimination based on conventional DNA fingerprinting. Genetic programming analysis determined the top six and two biomarkers from FTIR and NMR data, respectively, that discriminated ‘Cooler’ cultivars from ‘Equator’ cultivars. Overall results indicate that discrimination of higher plant cultivars by FTIR and NMR reflects genetic relationship between cultivars.
Plant calluses and cell suspension cultures were also subjected to FTIR and NMR, to determine whether pattern recognition based on metabolites profiles is able to discriminate plants calluses with the presence of embryogenic potential or not. PCA of the FTIR fingerprint region data and the NMR aliphatic and aromatic region data enabled discrimination of embryogenic calluses from nonembryogenic calluses. Hierarchical dendrograms based on PCA of the FTIR fingerprint region data and the NMR aliphatic and aromatic region data divided samples into embryogenic and nonembryogenic cells. However FTIR and NMR could not discriminate plant calluses according to taxonomic classification. Aamide I, II vibration of polypeptides, modification of aromatic compounds C=C stretch, and C=O stretch of an ester were significant characteristics of embryogenic calluses. GABA, tryptamine, and leucine were assigned as biomarkers for discriminating embryogenic callus from nonembryogenic callus in aliphatic region of $^1H$ NMR. These biomarkers seem to be derived from soluble aliphatic amino acids and related to the biomarkers from FTIR data, indicating a possible participation of these polyamine metabolites in determining embryogenic competence of calluses.
To confirm the resolution of metabolomic profiling in application of large scale screening from well defined genetic mutants, crude extracts of 201 activation-tagged hairy root mutants of Catharanthus roseus generated by infection with Agrobacterium rhizogenes were subjected to $^1H$ NMR for spectral fingerprinting. PCA of NMR data was able to discriminate one mutant prominently different from the others. The mutant appeared metabolically distinct from the others. PCA was also carried out with NMR data for each of the aliphatic, carbohydrate, and aromatic regions of the spectrum. The mutant discriminated from the others by PCA of total NMR data was also discerned by PCA of the carbohydrate region, indicating that a dominance of signals in the carbohydrate region made major contribution to metabolic discrimination of mutants. However, PCA of the aliphatic and aromatic regions discriminated other mutants from the others and most of the mutants separated by analysis of the aliphatic region were not the same as the mutants by analysis of the aromatic region, indicating that there existed aliphatic, carbohydrate, and aromatic mutants discriminated by PCA of NMR data. DNA fragments that contain the tagging sequence of these mutants are under investigation. Each metabolic mutant is probably generated by activation tagging of a regulatory gene for the metabolism. Overall results suggest that $^1H$ NMR spectral fingerprinting of hairy root mutants in C. roseus can be used for discovering putative metabolic regulatory genes. The potential use of comprehensive metabolomic analysis coupled to chemometric approaches for discriminatory phenotype analysis achieved in bacterial systems, yeast, mouse, and plants. Thus a comprehensive functional genomics research platform, that links metabolites profiling to gene expression arrays and protein profiles, will facilitate the cataloguing of genes.
여러 식물시료로부터 분석 스펙트럼 조사를 통하여 얻어진 다변량 데이터를 패턴인식방법으로 비교 분석함으로써 식물시료의 대사체 수준에서 고등식물의 종 구분, 품종 구분, 캘러스의 배발생능 보유 구분이 가능하였으며 더 나아가 다수의 일일초 모상근으로부터 대사체 수준의 신속한 탐색시스템을 확립하였다.
열분해질량분석기(pyrolysis mass spectrometry)는 진공조건에서에서 단시간에 고온(530 ℃, 3초)으로 화합물을 열분해하여 얻어진 열분해산물(pyrolysate)을 질량분석기를 통해 분석하는 장비로 패턴인식을 통해 유연관계가 높은 미생물의 분류 동정에 활용되고 있다. 푸리에 변환 적외선분광기(fourier transform infrared spectroscopy) 나 핵자기공명분광기(nuclear magnetic resonance spectroscopy) 역시 간편한고, 비파괴적인 조사를 통하여 화합물의 구조분석이나 혼합물의 대사체 수준의 분석에 활용되고 있으나 식물 재료를 이용한 활용 연구는 매우 제한적으로 보고되고 있다. 본 연구에서는 우선적으로 고등식물의 잎 조직을 열분해질량분석기 및 푸리에 변환 적외선분광기에 적용하여 얻어진 다변량 데이터를 패턴인식 및 계층군집분석법으로 조사한 결과 고등식물의 분류체계에 따른 구분이 가능하였다. 또한 유연관계가 매우 높은 일일초의 여러 품종을 대상으로 분석스펙트럼의 통계적 분석기법을 적용한 결과, RAPD 나 AFLP 기법에 의한 유연관계 결과와 비교하여볼 때 ‘Cooler’ 와 ‘Equator’ 계열의 품종을 성공적으로 구분할 수 있었다. 아울러 GP 분석방법을 통하여 구분에 이용되는 변수 즉 biomarker들을 식별하였다. 이상의 결과로 미루어 볼 때 식물시료로부터 분석스펙트럼의 통계적 분석기법에 의한 대사체 수준에서의 비교가 이미 미생물에서 보고된 바와 같이 유연관계에 따른 식물 시료의 구분에 간편하게 적용될 수 있음을 의미하는 것으로 식물의 돌연변이주나 유연관계가 높은 다수의 시료로부터 고속선발시스템의 확립에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
한편 분석스펙트럼의 대사체 수준 비교분석법을 매우 제한된 배양환경조건에서 유지되고 있는 식물 캘러스에 적용한 결과 흥미롭게도 배발생캘러스와 비배발생캘러스의 구분이 가능하였다. FTIR 분석에서는 amide I, II 진동(vibration)과 ester의 C=O stretch가 배발생캘러스에서 공통적으로 이루어지는 질적인 패턴 변화이었으며. NMR 데이터의 aliphatic 부분에서는 GABA, tryptamine, 그리고 leucine 등의 아미노산이 양적 변화가 비배발생세포에 공통적으로 이루어짐을 알 수 있었다. 이는 polyamine 계열의 아미노산 패턴변화가 식물 배발생세포주와 직접적인 관련이 있다는 보고들과 일치하는 것으로 사료된다. 이 결과는 분석스펙트럼이 세포의 생화학적 상태를 잘 반영하는 생물학적 정보를 제공하는 것으로 형태적 특징이 수반되지 않는 silent 변이주의 대사체 분석에 효과적인 분석도구로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
다수의 activation-tagged된 일일초 모상근으로부터 대사체 수준의 비교를 통하여 대사관련 조절유전자의 고속 탐색 및 기능 연구를 목적으로 총 201개 모상근의 NMR을 조사하였다. NMR 스페트럼을 전체, aliphatic, carbohydrate 그리고 aromatic 부분으로 나누어 패턴인식법으로 분석하여 각 부분으로부터 99% 신뢰수준에서는 1-2개, 95% 신뢰수준에서는 13-23개의 대사체 변이주를 선발하였다. 선발된 대사체 변이주들은 생장 속도 및 형태적 특징에서는 큰 차이를 보이지 않는 것으로 보아 대사 관련 조절유전자의 기능 변화가 이루어진 돌연변이주라 사료된다. 현재 선발된 돌연변이주의 유전자를 탐색중에 있다. 따라서 본 연구에서 확립된 대사체 수준의 비교연구 기술은 transcriptomics, proteomics 기술과 접목을 통하여 유전자의 신속한 기능 연구에 직접적으로 활용이 가능할 것으로 사료된다.
