We wanted to optimize the production of gutless adenovirus (GAd) using site-specific recombinase system. GAds lack almost the entire viral genome, excluding the noncoding sequences responsible for packaging (yr) and inverted terminated repeats (ITRs) sequences, thereby resulting in improved safety and capacity (up to 36 kb). The GAds can be propagated in the presence of helper Ad (HAd) that retains the ability to replicate and provide the necessary proteins in trans for the replication and packaging of GAds. In order to construct a HAd for GAd production using site-specific recombinase system, two parallel excision elements flanking packaging signal (yr) should be placed onto helper genome. When HAds are coinfected with GAds into 293 complementing site-specific recombinase, the yr sequence in HAds is efficiently excised, thereby rendering the HAd DNA unpackable and still providing all the functions necessary in trans for the replication and packaging of GAds.
There has been no report about comparison of GAd productions among different recombinase systems such as Cre/IoxP, FLP/FRT and FLPe/FRT. The comparison was done and best recombinase system (Cre) was adopted for optimization of GAd production finally. In this study, we constructed a HAd containing yi and enhanced GFP (EGFP) flanked by two parallel IoxP recognition sites (HAd/EGFP) as a model and investigated whether its use with flow cytometry enabled facilitating selection of 293Cre and titration of HAd during GAd amplification and production. Moreover, the effect of positioning a left excision element between LITR and packaging signal was investigated because it could have influence probably on excision efficiency of helper Ad.
In final chapter, we optimized the procedures of transfection, amplification and production of GAd vector in order.
위치특이적 재조합 효소계를 이용하여 유전자 치료용 gutless 아데노바이러스를 생산하는 연구를 수행하였다. 본 연구는 포장서열 (packaging signal)을 감싸는 동방향(parallel)의 절단부위 (excision element)들을 helper 아데노바이러스의 게놈상에 삽입하여, 생산세포주가 생산해내는 재조합 효소가 그 부위를 인식, 절단하여 궁극적으로 helper 아데노바이러스가 생산되지 않으면서 gutless 아데노바이러스만을 생산하게 하는 것이었다. 이 연구에서는 자연계에 알려진 세 가지 위치특이적 재조합 효소계들 (Cre/loxP, FLP/FRT, FLPe/FRT)을 도입하여 생산성을 비교한 후, 최종적으로 선택된 효소계를 가지고서 gutless 아데노바이러스의 생산을 최적화하는 시도를 하고자 하였다.
우선 293세포가 passage가 지남에 따라 성장과 바이러스 생산성에 영향이 있는지 조사하여 보았고, 결과적으로 passage의 영향을 받는 것을 확인하였다. 이어 gutless 아데노바이러스 벡터들과 포장서열을 감싸는 동방향의 절단 부위들이 들어간 helper 아데노바이러스들을 제작하였고, helper를 절단하고 gutless 아데노바이러스를 생산해 줄 재조합 효소를 생산하는 세포주를 제작하고 선별하는 과정을 고안하였다. 이렇게 제작, 선별된 바이러스와 세포주들을 이용하여 세 가지 재조합 효소계를 비교하였다. 결과적으로 Cre/loxP system이 선택되었고, 이들을 이용한 gutless 아데노바이러스 생산의 최적화 실험을 수행하였다.
최적화 조건에는 gutless 아데노바이러스의 벡터를 transfection하는 과정으로부터 시작하여 중간의 증폭단계과정에서의 조건, 그리고 마지막 단계에서의 gutless 아데노바이러스의 생산조건까지 살펴보았다.
