A sequence-specific termination signal of E. coli operon rrnB t1 recognized by bacteriophage RNA polymerases consists of conserved upstream-module (ATCTGTT in the non-template strand) and U-rich downstream-module. We previously elucidated the formation of paused conformation just prior to the point of RNA release. In this study, we observed sequential characteristic changes of ternary complex from more previous to the termination site. Elongation complexes of T7 RNA polymerase were stopped at desired positions by stepwise walking utilizing complex immobilization via biotin-streptavidin conjugation. The significant 9-nt upstream contact observed by photocross-link between nascent RNA and RNA polymerase in the elongation mode remarkably diminished from the third nucleotide position of the upstream-module. The release rate of the RNA in ternary complex was abruptly increased just before the conserved sequence and further increased near the point of RNA release if DNA templates contained intact upstream-module. Templates mutated termination signal showed that upstream-module appeared to contribute characteristic changes to cross-linking pattern and complex stability. At a few bp before the RNA release site, the slow intermediate complexes requiring high NTP concentration was observed. The collapse of transcription bubble was shown prior to termination. The normal transcription bubble shrank in the complex possessed intact upstream-module termination signal.
The sequential changes in elongating complex before termination suggested that termination is prepared from 15bp before the RNA release site and accompanied by the various conformational changes.
박테리오 파아지 RNA 중합효소는 두 종류의 인자 독립형 전사 종결을 인지한다. 그 중 머리핀 구조 비의존형 전사종결인자는 ‘ATCTGTT’ 라는 보존서열과 뒤에 ‘T’염기가 많은 부분이 존재하는 형태로 이루어져 있다. 대장균 오페론 rrnB T1에서는 염기서열 특이적으로 전사종결 신호가 인지되는데 앞선 연구에서 전사종결시점 두 염기 앞에서 높은 농도의 뉴클레오티드가 요구되는 느린 중간체의 출현을 연구한 바 있다. 이번 연구에서는 전사 종결을 위한 전사 복합체의 연속적인 변화를 추적 연구하였다. DNA를 고정시켜 원하는 위치에 전사 연장 복합체를 멈추어 분리하는 기술을 이용하여 -9위치의 RNA와 RNA 중합효소의 의미 있는 상호작용이 보존서열의 세 번째 위치부터는 사라지는 것을 확인하였다. 보존서열 두 번째 위치에서의 중합효소의 RNA 접촉부위도 연장단계와 다르다는 것을 확인하였다. 보존서열이 제대로 갖추어진 주형에서는 보존서열 위치부터는 RNA의 방출 속도가 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 여러 돌연변이의 확인결과 보존서열이 달라진 RNA와 RNA 중합효소의 상호작용과 복합체의 불안정화에 기여함을 알 수 있었다. 또한 3가지의 높은 농도의 뉴클레오티드를 요구하는 느린 단계의 중간 체를 전사종결 전에 확인할 수 있었는데 이는 이단계에서 복합체의 구조변화가 일어난다는 증거이다.
박테리오 파아지에 의한 염기서열 특이적 전사 종결은 RNA의 방출지점에서 최소한 15 bp 앞부터 연속된 복합체의 구조변화에 의해 순서적으로 이루어진다는 것을 밝혀냄으로써 머리핀구조 독립적인 전사종결 기작에 관한 새로운 모델을 제시하였다.
