The expression of glutamine synthetase (GS), catalyzing the ATP-dependent conversion of glutamate and ammonia into glutamine, is transcriptionally and post-transcriptionally regulated. The genomic structure of canine GS shown here is basically similar to that of other mammals in that it is composed of seven exons and six introns. Using 5’cRACE and RT-PCR, we identified an additional exon (120 bp) in the first intron, designated here as exon 1’. By means of alternative splicing, the GS gene produces an altered form of GS transcript with 5’-untranslated region (UTR) containing the exon 1’. This alternative transcript is abundantly expressed in brain, while it is found at lower level in other tissues. In the human and mouse GS genes, extra exons are also found at corresponding site of the intron 1 but with different sizes. An exon trapping experiment for the GS gene in COS-7, MDCK, and SK-N-SH cells revealed that the pattern of alternative splicing is variable in different cell types. The propensity of forming a secondary structure is predicted to be considerably higher with the presence of extra 5’-UTR, suggesting a possibility of translational effect. In order to test this, we carried out a reporter assay for fusions with different 5’-UTRs, demonstrating that the long form with extra 5’-UTR was translated 20- and 10-fold less than the short one in SK-N-SH and Neuro-2A cells, respectively. Similarly, translations of human and mouse transcripts with extra 5’-UTRs were less efficient, showing 6-8 fold reductions in SK-N-SH cells. Furthermore, when we mutated an ATG sequence contained in the exon 1’, the suppression of translation was partially relieved, suggesting that the negative regulation by an extra 5’-UTR is, to some extent, due to an abortive translation from the upstream ATG. This regulation was confirmed by comparing the in vitro translation products of capped in vitro transcripts for the short and long transcripts. From this experiment, we found that two GS isozymes were translated from the long transcript of canine GS. Besides the known 45 kDa protein, the long form of GS was expressed with additional 40 amino acids on its N-terminal end. When the long transcript was in vivo translated in animal cell lines, only the long GS was expressed. The in-frame uATG in the extra exon provided a translation initiator for the long form. We demonstrated, using tissue Western blotting experiment, that canine GS is highly expressed in brain, moderately in liver, and not translated in other tissues. However, the long form was found less than the short protein. In human and mouse brain tissues, only the 45 kDa GS bands were detected, for the uATGs in the extra exons are out of-frame. Subcellular fractionation of canine brain revealed that the long GS was found in all cellular compartments with the short one, which was corroborated by fluorescence microscopy data with green fluorescent protein (GFP) fused GS proteins. Using bacterial expression system, the recombinant GS proteins of 45 kDa and 49 kDa were purified and characterized, with $K_m$ values for L-glutamate of 1.1 mM and 1.3 mM, and ones for hydroxylamine of 1.6 mM and 1.7 mM, respectively. However, the $K_m$ values of ATP for the short and long GSs were slightly different, showing 1.3 mM and 1.9 mM respectively. The $K_i$ values for L-methionine-S-sulfoximine (MSOX), a competitive inhibitor of GS, were 0.067 mM and 0.124 mM for the short and long proteins respectively, suggesting that the affinity for MSOX is lower with the long GS than with the short one. It is conceivable that the alternative form of GS is present for diverse physiological needs of nitrogen metabolism.
전사단계와 전사후 단계에서 발현의 조절을 받는 글루타민 합성효소 (GS) 유전자는 개에 있어서, 다른 포유동물 들과 마찬가지로, 7개의 exon과 6개의 intron으로 구성되어 있다. 5’cRACE와 RT-PCR을 통하여 첫번째 intron내에 새로운 exon이 존재하는 것을 발견하였고, exon 1’으로 명명하였다. 선택적 스플라이싱에 의해, 개 GS 유전자는 exon 1’을 포함하는 변화된 전사체를 만들고 있었다. 이 새로운 전사체는 뇌에서 많이 발현되고, 다른 조직에서는 아주 약하게 생성되고 있었다. 인간과 쥐의 GS 유전자들에 있어서도, 첫번째 intron의 해당되는 위치에 여분의 exon이 존재하였다. 그러나 그 크기는 개와 달랐다. GS 유전자를 이용한 exon-trapping 실험을 통해 선택적 스플라이싱의 형태가 세포 특이적으로 일어남을 알았다. 길어진 전사체에 존재하는 5’ UTR의 번역단계 조절 가능성을 알아보기 위하여, luciferase를 이용한 reporter assay를 한 결과, neuroblastoma 세포들 내에서의 경우, 길어진 UTR이 작은 크기의 UTR보다 번역을 10-20 배 낮추었다. 사람과 쥐의 길어진 5’ UTR 또한 6-8배 번역을 낮추었다. Exon 1’ 내에 존재하는 upstream ATG를 TTG로 바꾸었을 때, 번역이 부분적으로 회복되는 것으로 보아, 길어진 5’ UTR의 번역조절에는 upstream ATG로부터 생성되어진 불완전한 번역체가 관여할 것으로 기대되어 진다. 이러한 조절현상을 GS 전사체와 rabbit reticulocyte lysate를 이용한 in vitro translation을 통하여 다시 한번 확인하였다. 이 실험을 통해, 개 GS의 길어진 전사체로부터, 알려진 45 kDa의 단백질 이외에 N-terminus가 40 아미노산 더 길어진 49 kDa의 단백질이 더 생성됨을 확인하였다. 실제 세포에서는 길어진 전사체로부터 오직 49 kDa의 GS만 만들어짐을 확인하였다. 이 단백질은 뇌에서 가장 많이 발현되었고, 간에서는 조금 생성되었고, 나머지 조직에서는 발견되지 않았다. 하지만 49 kDa 단백질의 농도가 45 kDa 단백질보다 항상 낮았고, 사람과 쥐의 뇌조직에서는 발견되지 않았다. 이 2가지 단백질은 세포질을 포함한 모든 소기관에 동일한 비율로 동시에 존재하는 것을 subcellular fractionation과 GFP fusion을 이용한 형광현미경 관찰로 확인하였다. 대장균내의 단백질발현시스템을 이용하여 2 종류의 GS 모두를 각각 순수하게 정제하여, 각 기질들에 대한 효소반응을 본 결과, L-glutamate와 hydroxylamine에 대한 $K_m$ 은 차이가 없었지만, ATP에 대한 $K_m$ 은 49 kDa의 GS가 더 높았다. 억제제인 L-methionine-S-sulfoximine (MSOX)에 대한 $K_i$ 또한 49 kDa의 GS가 더 높았다. 이는 이 길어진 효소가 알려진 GS보다 ATP와 MSOX에 대해 더 낮은 친화도를 갖는다는 것을 말해 준다. 이 새로운 형태의 GS가 생체 내 질소대사에 필요한 다양한 생리학적 요구에 관여할 것으로 기대된다.
