Caspase-mediated proteolysis is a critical and central element in the apoptotic process. Although it is important to identify the downstream molecular targets of capases, systematic and broadly applicable strategies to identify their substrates are not commonly available. This study established a systematic method for screening the substrate proteins for caspases by using a modified yeast two-hybrid system. The B42, the acidic domain of a transcriptional activator and a model substrate, poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) were fused to the Lex A DNA-binding domain. The fusion protein was expressed in the yeast strain, EGY48, while caspase-3 was expressed under GAL1 inducible promoter in the yeast strain, YM4271. These two yeast cells expressing the substrate protein and the caspase were mated and the cleavage of the substrate was monitored by measuring the ß-galactosidase activity. It was demonstrated that the cleavage of a model substrate (PARP), was effectively detected in the system. The results indicate that this method is of useful for screening the substrate proteins of caspases and possibly of other proteases.
14-3-3ε protein was identified as one of the caspase-3 substrates by the modified yeast two-hybrid system. The cellular 14-3-3ε protein was also cleaved in response to the treatment of apoptosis inducers in cultured mammalian cells. Asp238 of 14-3-3ε protein was determined as the site of cleavage by caspase-3. The affinity of the cleaved 14-3-3 mutant protein (D238) to Bad, a death promoting Bcl-2 family protein, was lower than that of wild type or the uncleavable mutant 14-3-3ε protein (D238A). However, Bad associated with the cellular Bcl-x(L) more effectively in human 293T cells co-expressing Bad with the truncated form of 14-3-3ε protein (D238) than in control cells co-expressing Bad with wild type or the uncleavable mutant 14-3-3ε protein (D238A). The present study suggests that the cleavage of 14-3-3 protein during apoptosis promotes cell death by releasing the associated Bad from 14-3-3 protein and facilitates Bad translocation to the mitochondria and its interaction with Bcl-x(L).
캐스페이즈를 매개로 하는 단백질 분해과정은 세포예정사 과정에서 중추적인 역할을 담당한다. 따라서 캐스페이즈의 기질을 탐색하는 것은 세포예정사 과정을 이해하는데 매우 중요하다. 그럼에도 불구하고 조직적으로 캐스페이즈의 기질을 탐색 선별하는 기술들은 별로 발달이 되지 않았다. 본 연구에서는 캐스페이즈의 기질 탐색을 위해 단백질-단백질 결합을 연구하는데 이용되어 온 효모 유전계를 변형한 시스템을 제작하였다. 제작된 본 시스템의 효용성을 증명하기 위해서 캐스페이즈-3와 그의 가장 널리 알려진 기질인 ADP-리보스 다중 중합효소 (PARP)를 이용하였다. ADP-리보스 다중 중합효소는 전사 활성자의 산성 부위인 B42와 DNA결합 부위인 LexA와 연결된 형태로 융합 단백질로서 발현이 된다. 캐스페이즈-3은 배지 내의 갈락토우스의 신호로 발현이 되게 된다. ADP-리보스 다중 중합효소를 포함한 융합 기질 단백질은 효모 균주의 한 종류인 EGY48균주에서 발현이 되며 캐스페이즈-3은 EGY48의 교배짝인 YM4271균주에서 발현이 된다. 기질 융합 단백질을 발현하고 있는 효모 균주와 캐스페이즈를 발현하고 있는 효모 균주를 교배시킨 다음에 기질 단백질의 절단은 베타-갈락토우스 분해효소의 활성을 통해서 확인할 수 있었다. 그 결과 캐스페이즈-3 모델 기질인 ADP-리보스 다중 중합 효소의 절단을 본 연구에서 제작한 변형된 효모 유전계를 이용해서 성공적으로 재현할 수 있었다. 이 결과를 보아 변형된 효모 유전계는 캐스페이즈와 다른 단백질 분해효소의 기질을 탐색하는데 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
변형된 효모 유전계를 이용하여 생쥐의 두뇌를 이용해서 만든 cDNA 라이브러리에서 캐스페이즈-3의 새로운 기질을 탐색하였다. 그 결과 14-3-3ε 단백질이 캐스페이즈-3의 기질임을 밝혀내었다. 효모세포에서 뿐 아니라 포유세포 배양 실험에서 세포예정사를 유도하는 자극을 주었을 때 14-3-3ε 단백질이 절단되는 것을 확인하였다. 캐스페이즈-3에 의한 14-3-3ε 단백질의 절단부위는 아미노산 서열 238번에 위치하는 아스파틱 산의 뒤라는 것을 확인할 수 있었다. 세포예정사를 조절하는 Bcl-2 과의 단백질중에서 Bad는 세포예정사를 유도하는 것으로 알려져 있으며 14-3-3 단백질과 결합한다고 알려져 있다. 캐스페이즈-3에 의해 잘려진 형태의 14-3-3 단백질 (D238)은 야생형의 14-3-3이나 캐스페이즈-3에 의해 잘려지지 않도록 돌연변이 시킨 14-3-3 단백질 (D238A)에 비해서 Bad와의 결합력이 무척 약하다는 것을 알 수 이었다. 또한 Bad와 잘려진 형태의 14-3-3 단백질을 과발현 시킨 293T세포에서 Bad는 세포내에 존재하고 있는 또다른 Bcl-2과의 단백질인 Bcl-x(L)과의 단백질과의 결합이 증가되고 있음을 확인하였다. 본 연구의 결과를 보았을 때 세포예정사 과정에서 캐스페이즈-3에 의해 절단된 14-3-3 단백질이 자신과 결합하고 있던 Bad 단백질을 방출시켜 미토콘드리아로 옮겨가게 하여 그곳에서 Bcl-x(L) 단백질과 결합하게 함으로써 세포사를 더욱 촉진시킨다고 여겨진다.
