Contents of isoflavone in whole soybeans of 6 traditional Korean strains and 1 imported soybean were in the range 193∼386 mg/100g cotyledon. In all the beans tested, malonylglycosides accounted for more than 70% of the total isoflavone, followed by glycosides. Hypocotyls contained 6∼17 times more isoflavone than corresponding cotyledons of the soybean, and thus hypocotyls was one of the most excellent source for the production of isoflavones. Isoflavones of soybean were extracted from soybean hypocotyls with aqueous ethanol. 60% of aqueous ethanol was the most suitable solvent for extracting isoflavone from the hypocotyls. Optimum temperature and time for the extraction was 60℃ and 1hr. At alkaline pH range, extraction yield was drastically reduced. Volume of extraction solvent/hypocotyl ratio (v/w) should be over 6. Isoflavones extracted from hypocotyls were purified by several methods. Adsorption chromatography could recover isoflavone and saponin. The pH was critical in the chromatographic process and the adsorption of isoflavones was maximum at pH 4.0. Adsorption of genistin on the resin was stronger than that of daidzin. Elution rate and height/diameter ratio also affected the recovery yield. Under the optimal conditions, about 85% of genistin and 70% of daidzin could be recovered. The draw back of chromatographic method was that saponins were also recovered as well as isoflavones. Ultrafiltration concentrated isoflavone when the crude extract was solubilized in water. When pH of concentrated solution of crude isoflavones was adjusted below 4, isoflavones were precipitated. At pH 1.5, more than 80% of isoflavones was precipitated and the malonylglycosides were found to be most sensitive to pH. When the precipitates were suspended in 40% aqueous ethanol, only isoflavone and saponin were solubilized while contaminants including proteins, lipids and other substances were precipitated. For the removal of saponins, divalent cations such as $Ca^{2+}$, $Mg^{2+}$ and $Ba^{2+}$ were added to the solution and were found to selectively precipitate saponin at pH 12. Addition of calcium hydroxide de-esterified the malonylglycosides while precipitating saponins. With this method, glycosides of isoflavones were separated from saponins and the purity of isoflavone was 87%. Malonyl residue of malonylglycosides was de-esterified during the extraction and purification process. The treatment of malonylglycosides with an alkali having a higher pH resulted in a higher de-esterification. In addition, heating at a higher temperature for a longer time resulted in a higher reaction rate. As the concentration of ethanol was increased to over 60%, the relative concentration of malonylglycosides decreased. Hydrolysis of glycosides into their aglycones was investigated with lactic acid bacteria. Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii KCTC 1047, grown in MRS or soymilk media, completely hydrolyzed the isoflavone glycosides, genistin and daidzin at 50 ㎍/mL, into their respective aglycones, genistein and daidzein within 30 min. Other lactic acid bacteria did not produce β -glycosidase, the enzyme responsible for the hydrolysis of isoflavone glycosides, when cultured in MRS medium. Glycoside-hydrolyzing activity was induced in these lactic acid bacteria when cultured in soymilk medium. When soymilk, containing sucrose as a sugar source was fermented with lactic acid bacteria, small amount of lactic acid (0.16-0.29%) was produced but isoflavone glycosides were fully hydrolyzed. Supplementation of glucose or lactose was required for normal lactic acid production and affected the hydrolysis of isoflavone glycosides. In the case of L. delbrueckii subsp. delbrueckii KCTC 1047, glycosidic bond of isoflavone was fully hydrolyzed regardless of glucose supplementation. But only 25-40% of daidzin and 70-80% of genistin was hydrolyzed when glucose was added into soymilk in the case of other lactic acid bacteria. The isoflavone-hydrolyzing enzyme, β-glycosidase produced by lactic acid bacteria except L. delbrueckii subsp. delbrueckii KCTC 1047 was induced during the fermentation of soymilk and its production was suppressed by addition of glucose.
대두 배아로부터 에탄올 수용액을 이용하여 이소플라본을 추출하였다. 최적 에탄올 농도는 40-60%이었으며, 60℃에서 한시간 정도 추출하는 것이 최적이었다. 높은 추출온도에서는 말로닐 유도체가 일부 탈에스터반응을 일으켰다. 알칼리첨가는 추출효율을 크게 감소시켰으며, 배아중량 대비 최소 6배 부피의 용매가 필요하였다. 우리나라 전통의 콩과 수입콩의 이소플라본 함량과 조성을 비교한 결과 대두 100g 당 193∼386mg의 이소플라본이 추출되었으며, 70% 이상은 말로닐 유도체 형태로 존재하였다. 배아는 배엽보다 6-17배의 이소플라본이 포함되어 이소플라본의 생산 원료로 매우 적합한 것으로 나타났다.
이소플라본을 정제하기 위하여 흡착크로마토그라피, 한외여과, 그리고 용매 분획법을 실시하였다. pH 4에서 흡착수지에 가장 높은 흡착을 보였고, 제니스타인이 다이드제인보다 강하게 흡착되었으며, 높이/직경비율, 용출속도 등이 회수 효율에 영향을 미쳤다. 최적 조건에서 85%의 제니스틴과 70%의 다이드진이 회수되었고, 올리고당, 단백질 등을 제거할 수 있었지만 사포닌은 제거할 수 없었다. 추출액을 한외여과로 정제한 결과, 수용액에서는 약 4배의 농축효과가 보였고 에탄올 수용액에서는 2배의 농축효과를 보였다. 단백질은 약 50% 정도가 제거되었다. 추출액의 pH를 1.5로 조절하면 원액의 80% 이상의 이소플라본이 침전되었으며, 특히 말로닐 유도체는 90% 이상 침전되었다. 따라서 회수율을 높이기 위해서는 추출공정에서 말로닐 유도체의 가수분해가 일어나지 않도록 추출조건을 조절해야 한다. 침전물을 에탄올 수용액에 다시 용해시키면, 사포닌과 이소플라본은 쉽게 용해되지만, 단백질, 지방 등은 침전되었다. 이러한 공정을 통해 순도 30% 내외의 제품을 생산할 수 있었다. 또한 이소플라본 용액의 pH를 12로 조절한 후 2가 양이온 염을 첨가하면 이소플라본의 말로닐 유도체가 탈에스터반응으로 인하여 배당체로 전환되었으며, 사포닌은 침전되었다. 원심분리로 이소플라본 분획을 분리하였다. 이러한 방법으로 고순도의 이소플라본과 사포닌을 각각 생산할 있었다.
말로닐 유도체의 말로닐 잔기는 열에 매우 약하여 추출이나 가공 공정중에 분해되는 것으로 알려져 있다. 이소플라본의 말로닐 유도체는 고온에서, 또 알칼리성 pH에서 더 빨리 탈에스터반응이 일어나서 말로닐 잔기가 제거되었다. 또한 용매의 농도가 높을 때 더 빠르게 분해되었다. 이소플라본 배당체의 당잔기는 유산균이 생산하는 β -glycosidase에 의해 가수분해되었다. 균주에 따라 β -glycosidase의 생산이 차이를 보였다. L. delbrueckii subsp. delbrueckii KCTC 1047은 생육배지와 무관하게 이 효소를 생산하였지만, 다른 유산균들의 경우 MRS 배지에서는 효소가 생산되지 않았지만. 두유배지에서는 유도되었다. 유산균을 이용한 두유 요구르트 발효에서 포도당이나 젖당을 첨가하면 정상적인 발효가 진행되었지만 이소플라본 배당체의 가수분해는 저하된 반면, 설탕을 첨가하였을 경우에는 균체생육과 젖산생산은 미약하였지만 이소플라본의 가수분해는 높았다. L. delbrueckii subsp. delbrueckii KCTC 1047은 당 첨가에 의해 이소플라본 배당체의 가수분해가 영향을 받지 않았다. 즉 이소플라본 가수분해 효소는 균주에 따라 생성기작이 다르며, 두유배지에서 유도되는 효소인 경우 포도당 첨가에 의해 효소생산이 저해되었다.
