Apoptosis is a mechanism that removes abnormal or no longer needed cells. Caspases, a class of cysteine protease, are key element of apoptosis, and they cleave various polypeptides resulting in cellular structural changes. Despite the importance of caspases, the mechanisms regulating caspases and proteins cleaved by caspases remains to be elucidated. Moreover, apoptotic subprogrammes, such as cell shrinking and the emission of pro-engulfment signals are not clearly understood yet.
To find caspase substrates and elucidate genetic pathways related to caspases, we generated a transgenic fly overexpressing Drosophila caspase, dcp-1, in its eye using GAL4/UAS system. Flies carrying one copy of UAS-dcp-1 and gmr-GAL4 exhibited a distinct phenotype in eye, in which the level of pigment was reduced. Transgenic flies carrying another Drosophila caspases, dronc and dredd, were also generated. Flies carrying one copy of UAS-dronc and gmr-GAL4 exhibited ablated eye. And flies carrying one copy of UAS-dredd and gmr-GAL4 exhibit rough eye.
Since RPR and HID have been known as proapoptotic proteins in fly, we crossed UAS-dcp-1 flies to gmr-rpr, gmr-hid flies. Flies coexpressing dcp-1 and rpr in their eye was died as pupa, while flies coexpressing dcp-1 and hid in their eye exhibited almost same phenotype compared to the eye of gmr-hid flies. We also crossed gmr-dcp-1 flies to gmr-p35 flies since p35 has been known as a specific inhibitor of caspases. The eye phenotype induced by dcp-1 was suppressed by crossing these flies to gmr-p35 flies. These results imply that DCP-1 genetically interacts with RPR and p35 but not with HID.
To perform genetic screening, we generated gmr-dcp-1 flies, which gmr-GAL4 and UAS-dcp-1 is in the same second chromosome. Because two copies of gmr-dcp-1 caused a reduced fertility, male flies carrying one copy of gmr-dcp-1 were crossed with females from EP library or female flies containing various signal transduction genes. We screened 14,816 lines and isolated 296 lines that exhibited severe or rescued eye phenotype. In order to confirm that alteration in eye phenotype was due to the interaction between gmr-GAL4, DCP-1 and EP library, we compared the phenotype of flies carrying gmr-GAL4 and each EP with the phenotype of flies carrying gmr-GAL4, UAS-dcp-1 and each EP. Flies exhibiting similar phenotypes at both cases were excluded. Then insertional positions of EPs were analyzed using sequence information and 39 genes that genetically interact with dcp-1 were defined. These categorized into three groups. First group included kinases and phosphatase. Second group included transcription/translation-related genes including RNA polymerase Ⅱ transcription factors, ecdysone-induced proteins and so forth. Third group includes ubiquitin conjugating enzyme, ubiquitin-specific protease, diap1 and so on.
Apoptosis는 비정상적이거나 쓸모 없어진 세포를 제거하는 메커니즘으로 동물의 발생과정에서 흔히 볼 수 있다. Cysteine protease의 일종인 caspase는 apoptosis의 중추적인 효소로 세포 내의 apoptosis signal을 받아 세포 내의 다양한 protein을 잘라 세포에 큰 변화를 일으킨다. 그러나 그 중요성에 비해 mechanism은 정확히 알려지지 않았다. 또한 apoptosis의 하위 프로그램인 cell shrinking, engulfment를 위한 signal들의 세포 외부로의 방출 등은 잘 알려지지 않았다.
Caspase의 substrate를 밝히고 그 mechanism을 규명하기 위해 우리는 GAL4/UAS system을 이용하여 초파리 caspase인 dcp-1이 third instar시기부터 눈에서 과다발현 되는 형질전환 초파리를 만들었다. UAS-dcp-1과 gmr-GAL4를 1 copy씩 가지는 초파리는 눈에서 색소가 적게 발현되고, 크기가 약간 줄어든 표현형을 보였다. 또한 우리는 다른 초파리 caspase인 dronc 혹은 dredd를 가진 형질전환 파리도 만들었다. UAS-dronc와 gmr-GAL4를 한 쌍씩 가지는 초파리는ablated eye를 보였고, dredd와 gmr-GAL4를 한 쌍씩 가진 초파리는 rough eye를 보였다.
RPR과 HID는 초파리의 apoptosis를 촉진시키는 단백질로 알려져 있기 때문에 우리는 UAS-dcp-1을 가진 초파리를 gmr-rpr, gmr-hid를 가지는 초파리와 각각 교배했다. rpr와 dcp-1가 눈에서 같이 발현된 초파리는 23℃와 18℃에서 pupa상태로 죽었다. 반면, dcp-1과 hid를 같이 발현시킨 초파리는 hid만 발현된 초파리와 차이가 없었다. 이것은 dcp-1이 rpr와 상호작용하지만 hid와는 상호작용하지 않는다는 것을 나타낸다. 또한 우리는 caspase의 억제 단백질로 알려진 p35를 가진 초파리와 dcp-1을 가진 초파리를 gmr-GAL4를 이용하여 눈에서 같이 발현시켰다. 이들의 자손은 모두 정상적인 눈을 보였다. 또한 EP element와의 screen을 통해 DIAP1이 과다발현 되었을 때 DCP-1에 의해 변화된 눈을 정상적인 눈으로 되돌리는 것을 보였다. 이는 p35와 DIAP1이 효과적으로 DCP-1의 기능을 억제하였음을 나타낸다.
Screening을 하기 위해 우리는 gmr-GAL4와 UAS-dcp-1이 homologous recombination에 의해 2번 chromosome에 같이 들어간 gmr-dcp-1 초파리를 만들었다. gmr-dcp-1을 두 copy씩 가진 초파리는 적은 수만이 태어나기 때문에, 우리는 gmr-dcp-1을 한 copy씩 가지는 virgin 초파리를 EP의 수컷들 혹은 signal transduction에 관련된 유전자를 가지는 초파리의 수컷들과 교배했다. 이렇게 해서 총 14,816개의 line중 표현형이 변화된 296개의 line을 골라내었다. 눈의 표현형의 변화가 gmr-GAL4와 EP에 의해 발현된 endogenous gene과 dcp-1의 상호작용에 의해 일어난 것인지 확인하기 위해, 우리는 candidate들을 gmr-GAL4와 교배했고, 양쪽 경우에서 유사한 표현형을 보이는 line은 제외되었다. 그리고 EP의 genome상의 위치를 sequence 분석을 통해 알아내었고, EP들에 의해 영향을 받는 유전자를 찾았다. signal transduction관련 유전자와 EP에 의해 영향을 받는 유전자 39개를 찾아냈다. 이들은 세 종류로 분류되는데, 첫번째 그룹은 kinase와 phosphatase를 포함한다. 두 번째 그룹은 전사와 번역에 관계된 유전자를 포함하는데 이 중에는 RNA polymerase Ⅱ transcription factor와 곤충 호르몬인ecdyson에 관련된 유전자들이 있다. 세 번째 그룹에는 ubiquitin관련 유전자들과 diap1, rac1등의 다양한 유전자들이 있다.
