The PLZF (promyelocytic leukemia zinc finger) gene was first identified as being fused to the retinoic acid receptor alpha (RARα) gene through a t(11;17)(q23;q21) translocation in a patient with acute promyelocytic leukemia and the PLZF protein has been known as a Kruppel-like transcription suppressor.
To investigate the biological role of PLZF other than the role in transcription regulation, we cloned the full length PLZF gene encoding 673 amino acids and the partial cDNA in which BTB (Broad-Complex, Tramtrack, and Bric $à:$brac)/POZ (poxvirus and zinc finger) domain was omitted. The 120 amino acid BTB/POZ domain is found at N-terminus of the protein and mediates dimerization. To examine the role of PLZF in vivo, we generated transgenic fly carrying the PLZF gene, which was subcloned in pUAST vector. When PLZF was mis-expressed in Drosophila eye or wing using GAL4-UAS modular expression system, major deformities, such as disordered rough eye, increased number of photoreceptors, scattered arrangement of photoreceptors and additional veins in wings, were observed. These phenotypes were consistent with those induced by enhanced MAP kinase cascade. These results show that the PLZF has the possibility in regulating MAP kinase cascade. To confirm this possibility, we crossed the transgenic flies harboring UAS-PLZF and an appropriate driver (MS1096-GAL4 or gmr-GAL4) with hypomorps or amorph in which the activity of Ras pathway components was reduced or diminished. When the transgenic flies mis-expressing PLZF were crossed with $phl^12$, hypomorph of phl (Raf ortholog), the phenotypes of the progenies harboring both parental genes were not different from those of flies mis-expressing PLZF. In other words, the rough eye phenotype of the flies mis-expressing PLZF did not affected by hypomorphic mutation at phl. However, in the case of Dsor1LH110, amorph of Dsor1 (MEK, MAPK kinase ortholog), rl1, hypomorph of rl (ERK ortholog), which are downstream of phl, the deformities observed in the phenotypes of flies mis-expressing PLZF were reduced. Particularly the additional veins in wings were disappeared and the disordered arrangement of photoreceptors was recovered into normal arrangement. These results suggest that PLZF genetically interacts with Dsor1 and rl of ERK pathway in Drosophila melanogaster. In order to confirm the interactions among PLZF, Dsor1 and rl, we investigated the effect of human MKP3-like phosphatase (DMKP3), which is known as specific for ERK on the phenotypes of flies mis-expressing PLZF. When DMKP3 was over expressed together with PLZF in eye or wing, the ommatidia in the complex eye of the flies mis-expressing PLZF and DMKP3 were arranged in a quite different fashion compared to the eyes of the flies mis-expressing PLZF and the additional veins in the wing of flies mis-expressing PLZF were completely disappeared.
In order to investigate biological meaning of the interaction between PLZF and components in the ERK pathway in a liver-derived HepG2 cell, we performed ERK posphotransferse activity assay using a peptide substrate and MBP after transfection with PLZF expression vectors. ERK kinase activity was enhanced by the expression of PLZF and these activations were completely inhibited by the addition of a MEK inhibitor (PD98059). In addition, Western blotting using phosphorylated ERK specific antibody revealed that the level of ERK1 phosphorylation was closely related to the enhancement of ERK activity by the expression of PLZF. In addition, the △BTB/POZ-PLZF, missing BTB/POZ domain, up-regulated ERK activity. Based on these results and the observed genetic interactions between PLZF and ERK pathway, we concluded that the PLZF protein positively regulates ERK activity by interacting with MEK. The more detailed investigation of interaction between PLZF and components of ERK pathway will shed light on its role in regulating cell signaling.
PLZF 유전자는 급성 전골수 세포 백혈병 환자에서 t(11;17)(q23;q21) 전좌(轉座)에 의한 retinoic 산 수용체 알파 유전자와 융합 되어진 형태로 확인되었다. 그리고, 이 PLZF 단백질은 kruppel 모양을 한 전사 억제자로 알려져 있다. 전사조절 인자로서가 아닌 PLZF의 또 다른 생물학적 역할을 연구하기 위해서, 673개의 아미노산을 발현하는 PLZF 전체 유전자와 BTB/POZ 영역이 제외된 부분적인 PLZF 유전자를 클로닝 하였다. 120개의 아미노산에 해당되는 BTB/POZ 영역은 PLZF 단백질의 N-말단에 위치하여, 이합 체 형성을 중재한다. 생물체내에서 PLZF의 영향을 조사하기 위해서, pUAST 벡터에 서브클로닝 된 PLZF 유전자를 가지는 형질전환 초파리를 만들었다. GAL4-UAS 발현 시스템을 사용하여 PLZF를 초파리 내에서 과다 발현시켰을 때, 불규칙적이고 울퉁불퉁하게 된 눈, 증가된 광 수용체의 수, 분산된 광 수용체의 배열, 그리고 날개에서 추가적으로 생성된 시맥 (翅脈)과 같은 주요한 변형들이 관찰되었다. 이러한 표현형은 활성화된 MAPK 신호전달 경로에 의해 유발되는 표현형과 일치했다. 이러한 결과는 PLZF가 MAPK 신호전달 경로를 조절한다는 가능성을 보여준다. 이것을 증명하기 위해서, UAS-PLZF와 눈 또는 날개에 특이적인 driver (MS1096-GAL4 또는 gmr-GAL4)를 함께 가지는 형질전환 초파리와 ERK 신호전달 경로의 구성 요소들의 활성이 감소된 초파리를 교잡하였다. PLZF를 과다 발현하는 형질전환 초파리와 Raf의 유사 체에 해당하는 phl의 기능이 감소된 초파리를 교잡하여 얻어진 자손의 표현형을 관찰했을 때, PLZF가 과다 발현되는 초파리의 표현형과 다르지 않았다. 다시 말해서, phl 유전자의 기능 감소가 PLZF의 과다 발현으로 유발된 표현형에 영향을 주지 못 했다. 그러나, MAPK 신호전달 경로에서 phl의 아래에 위치하는 Dsor1과 rl의 경우에서는 결과가 달랐다. Dsor1과 rl의 기능이 감소된 초파리를 각각 PLZF가 과다 발현되고 있는 초파리와 교잡했을 때, PLZF 형질전환 초파리에서 보여지는 시맥들이 날개에서 사라졌고, 광 수용체들의 불규칙적인 배열도 규칙적인 형태로 돌아갔다. 이러한 결과는 초파리 내에서 PLZF가 Dsor1과 rl와 유전적으로 상호작용하고 있음을 말해준다. PLZF, Dsor1 그리고 rl가 서로 상호작용하고 있다는 것을 확증하기 위해서 ERK에 특이적으로 작용하는 초파리 MAPK phosphatase (DMKP3)가 PLZF 형질전환 초파리의 표현형에 어떠한 영향을 미치는지에 대해 알아보았다. DMKP3가 PLZF와 함께 눈 또는 날개에서 과다 발현되었을 때, 눈의 격자들이 PLZF 형질전환 초파리의 눈 격자들과는 다른 형태로 배열되었다. 또한, PLZF 형질전환 초파리에서 보여지는 추가적으로 생성된 시맥들도 사라졌다.
HepG2 세포에서 PLZF와 ERK 신호전달 경로의 요소들 사이에서 일어나는 상호작용의 생물학적 의미를 조사하기 위해서, PLZF를 발현하는 벡터를 트랜스펙션 한 후에 펩타이드 기질 또는 MBP를 사용하여 ERK의 인산기 전달 활성 정도를 분석하였다. ERK의 인산기 전달 활성은 PLZF 발현에 의해서 증가되었고, 이것은 MEK 저해제인 PD98059에 의해서 완전히 저해되었다. 그리고, 인산화 된 ERK에 특이적으로 작용하는 항체를 사용한 western blotting을 통해서 ERK1의 인산화 정도가 PLZF 발현에 의한 ERK1의 활성의 증가와 밀접한 관계를 가짐을 알 수 있었다. 위의 결과와 이제까지 보여진 PLZF와 ERK 신호전달 경로의 유전학적 상호작용에 근거하여, PLZF 단백질이 MEK와 상호작용 함으로써 ERK의 활성을 양성적으로 조절한다는 결론을 내렸다. PLZF와 ERK 신호전달 경로 사이의 상호작용에 대해 더 세부적인 실험을 해나간다면 세포 신호전달 조절에 있어 PLZF의 역할을 좀 더 명확히 밝혀낼 수 있을 것이다.
