The cytoskeletal matrix assembled at active zones (CAZ) is implicated in defining neurotransmitter release sites. However, little is known about the molecular mechanisms by which the CAZ is organized. Here we report a novel interaction between Piccolo, a core component of the CAZ, and GIT proteins, multidomain signaling integrators with GTPase-activating protein activity for ARF small GTPases. A small region (∼150 aa residues) in Piccolo, which is not conserved in the closely related CAZ protein Bassoon, mediates a direct interaction with the SHD domain of GIT1. Piccolo and GIT1 colocalize at synaptic sites in cultured neurons. In brain, Piccolo forms a complex with GIT1 and various GIT-associated proteins including bPIX, focal adhesion kinase, liprin-a and paxillin. Point mutations in the SHD of GIT1 differentially interfere with the association of GIT1 with Piccolo, bPIX and focal adhesion kinase, suggesting that these proteins bind to the SHD by different mechanisms. Intriguingly, GIT proteins form homo- and heteromultimers through their C-terminal GRKBD domain in a tail-to-tail fashion. This multimerization enables GIT1 to simultaneously interact with multiple SHD-binding proteins including Piccolo and bPIX. These results suggest that, through their multimerization and interaction with Piccolo, the GIT family proteins are involved in the organization of the CAZ.
전시냅스 actize zone의 cytoskeletal matrix (CAZ)는 시냅스 소포(synaptic vesicle)의 신경신호전달물질의 방출과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있으나, CAZ의 구성에 관한 구체적인 분자적 기전에 관해서는 알려진 바가 별로 없다. GIT은 ADP-ribosylation factor GTPase-activating protein인 동시에 여러 가지 신호전달 단백질 또는 scaffolding 단백질과 상호작용하는 매우 흥미로운 단백질이다. 본 연구에서는 yeast two-hybrid screen을 통하여 GIT이 CAZ를 구성하는 핵심 단백질중의 하나인 Piccolo와 상호작용한다는 것을 알아내었다. Yeast two-hybrid assay와 GST pulldown assay를 통하여, GIT1,2의 SHD domain이 Piccolo와 직접적인 결합을 하고 있으며, Piccolo와 밀접한 관계에 있는 또다른 CAZ 단백질인 Bassoon과는 결합하지 않음을 밝혀내었다. Piccolo와 GIT1는 cultured neuron의 synaptic site 중 일부에서 같이 존재하며, 생화학적으로 뇌에서 GIT-associated protein인 bPIX, focal adhesion kinase, liprin-a, paxillin등과 함께 복합체를 이루고 있었다. Point mutagenesis를 통하여 GIT의 SHD domain에서 Piccolo와의 상호작용에 중요한 residue를 알아내었고, SHD mutant에 대한 Piccolo, bPIX, FAK의 결합양상이 각기 다른 것으로 볼 때, 이들은 SHD에 각기 다른 방식으로 결합하는 것으로 생각된다. GIT는 C-terminal GRKBD domain을 통해 동종, 이종 다합체를 형성하며, 이를 통해 Piccolo와 bPIX와 동시에 상호작용할 수 있었다. 이러한 결과들은 GIT 단백질이 다합체 형성과 Piccolo와의 상호작용에 의하여 CAZ의 구성에 기여할 것임을 시사한다.
