CHAPTER 1. Controlling Nonspecific Protein Binding in PEG(poly-ethylene glycol)-conjugated PAMAM Dendrimer Monolayers on Gold.
PEG has been widely used as a coating material for biosensor applications because of biocompatibility, enhancing hydrophilicity and flexibility, and reducing non-specific binding (NSB) of proteins on a surface. This chapter describes characteristics of a PEG-conjugated PAMAM dendrimer and its monolayers as a new chip platform. Synthesis of PEG-conjugated fourth generation PAMAM dendrimer and its monolayer formation were identified by performing NMR analysis, Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy, contact angle measurement and ellipsometry. And, nonspecific protein adsorption on PEG-conjugated PAMAM dendrimer monolayers was examined by conducting surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy. According to an elemental analysis by 2D-NMR, $^1H-$, and $^{13}C-NMR$ analysis, the fourth generation PAMAM dendrimer (G4) as a starting material was PEGylated with a degree of 95 ± 2 %. From FT-IR spectroscopy on the monolayers of PEG-conjugated PAMAM dendrimer assembled on a MUA-SAM/Au surface, amide coupling between dendrimers and PEG groups and existence of a C-O-C ether linkage in a tethered PEG moiety were demonstrated. The surface wettability measurement on the monolayers of PEG-conjugated PAMAM dendrimers was 25.2 ± 2˚ of contact angle, more hydrophilic than PAMAM dendrimer monolayers of 31 ± 2˚. By ellipsometry, the film thickness of PEG-conjugated PAMAM dendrimer monolayer assembled on SAM/Au surface was 58 ± 2Å, suggesting substantial distortion of the layer on the flat Au surface. The NSB effects for typical proteins were investigated such as bovine serum albumin (BSA) and anti-bovine IgG. The PEG-containing surface was more resistant to non-specific protein adsorption, yielding nearly 10% NSB level for both proteins compared to those from PAMAM dendrimer monolayers. These results support that PEG-conjugated PAMAM dendrimer is a promising material for biosensors and biochips application.
CHAPTER 2. Mass Spectrometry after On-chip Digestion of Target Analytes on Dendrimer-based platform.
The field of proteomics is expanding rapidly since the completion of the human genome because genomic information is often insufficient to understand biomolecular mechanisms. Proteomics was first developed as a technique using 2-D gel electrophoresis and mass spectroscopy to generate a part list of the proteins contained in a proteome. But the conventional methods limit complete understanding of proteomics. Recently, the concept of on-chip digestion and analysis through MS was introduced as a technical challenge. With this viewpoint, this work includes selective capture of antigens based on an antibody-layered chip, on-chip digestion by protease of trypsin, and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight/time-of-flight mass spectroscopy (MALDI-TOF/TOF MS). In addition, we examined the efficiency of on-chip digestion method and optimized because irreversible enzyme binding to surfaces and inaccessibility of enzymes to bound analytes are expected to limit digestion efficiency. In chip-based assays, the layers of antibody probes were prepared by employing the fourth generation PAMAM dendrimer (G4) monolayers on a SAM surface as a chip platform, bridging with a linker to attach Protein A, and treating antibody probes under the specified condition. In these ways, the molecular orientation of assembled antibody molecules that their Fc regions are captured to Protein A and antigen-binding sites are surface-exposed was controlled. A variety of antibody-antigen couples were chosen and the performance of on-chip digestion and MALDI-TOF/TOF MS method was determined by analyzing only the target and the protein mixture including a target protein. In both conditions, the trypsin-digested BSA protein can be detected to 150 fmol, comparable to the result from in-solution digestion with the detection limit of 100 fmol. The selectivity of antibody-antigen interactions onto the specified antibody layers was also tested.
CHAPTER 1.폴리에틸렌 글라이콜이 함유된 덴드리머 단분자막에서 단백질의 비 특이적 흡착 저해에 관한 연구.
비 특이적 단백질 흡착을 줄이기 위한 목적으로 PEG가 함유된 PAMAM dendrimer가 새로운 단백질 칩 기반물질로서 도입되었다. PEG가 함유된 PAMAM dendrimer는 PAMAM dendrimer (G4)의 끝부분인 아민기에 PEG를 결합시키는 방법을 이용해서 합성하였다. 1H-NMR와 13C-NMR의 원소정량분석을 통해 PEG가 PAMAM dendrimer (G4)에 95 ± 2 %정도 합성된 것이 확인되었고 이는 PAMAM dendrimer (G4)의 끝부분에 있는 64개의 아민기 중에서 61개가 PEG로 변형되었음을 알 수 있다. 단백질 칩의 응용을 위해 고체표면에 PEG가 함유된 PAMAM dendrimer의 단분자막 형성은 FT-IR spectroscopy, contact angle 측정, 그리고 ellipsometry 분석을 통해 확인되었다. PEG가 함유된 PAMAM dendrimer 단분자막의 아마이드 결합과 에테르 결합은 FT-IR 스펙트럼을 통해 확인되었다. Contact angle 측정을 통해 PEG가 함유된 PAMAM dendrimer 단분자막이 PAMAM dendrimer (G4) 단분자막에 비해 친수성이 증가했으며 이러한 특성은 비 특이적 단백질 흡착 저해효과에 대한 가능성을 보여준다. 또한 PEG가 함유된 PAMAM dendrimer 단분자막의 표면두께는 ellipsometry를 통해 측정하였다. 위의 결과들을 통해 PEG가 함유된 PAMAM dendrimer 단분자막이 잘 형성되었음을 알 수 있다. 실제적인 바이오센서와 단백질 칩의 응용을 위해서 BSA와 anti-bovine IgG을 모델단백질로 해서 SPR 분석을 통해 비 특이적 단백질 흡착 효과여부를 실험하였다. 기존의 PAMAM dendrimer (G4) 단분자막에 비해 비 특이적 단백질 흡착이 10%로 줄어드는 것으로 확인되었다. 따라서 본 연구의 결과들은 PEG가 함유된 PAMAM dendrimer 단분자막이 비 특이적 단백질 흡착에 대한 효과가 있음을 밝히고 이를 통해 바이오센서와 단백질 칩의 응용에서 새로운 기반물질로의 사용가능성을 제시한다.
CHAPTER 2. 덴드리머로 제작한 단백질 칩 상에서 반응단백질의 효소 분해 및 MALDI-TOF/TOF MS (메트릭스를 이용한 이온화 질량분석기)를 통한 분석 연구.
인간게놈서열이 밝혀지면서 단백질의 기능과 상호작용을 in-vitro 수준에서 대량 분석하는 기술과 시스템의 개발에 대한 연구가 폭 넓게 이루어지고 있다. 이러한 목적으로 2차 전기영동 후 질량분석기를 이용하는 기술이 일반적으로 사용되고 있으나 민감도, 시료처리 및 시간소요 등의 한계점을 보이고 있다. 본 연구에서는 이에 대체할 만한 기술로서 칩 표면에 생체분자를 고정화시킨 후 효소분해를 한 후 질량분석기로 분석하는 개념을 도입하여 효율성을 검토하였다. 우선 칩 표면에 생체분자를 고정화시키기 위한 방법으로 금 박막위에 자기조립단분자막을 형성하고 덴드리머 (G4)를 집적한 후 linker를 이용해서 Protein A를 고정화시킨 다음 항체를 처리하여 항체의 Fc 부위와 Protein A가 결합하게 하는 것으로 항체 단분자막을 제조하였다. 그리고 분석하고자 하는 항원을 처리한 후 protease의 한 종류인 trypsin으로 이 단백질을 효소 분해하였고 MALDI-TOF/TOF MS (메트릭스를 이용한 이온화 질량분석기)를 통해 분석하였다. 생체분자를 칩 고체 표면에 고정화시키기 때문에 trypsin이 고체표면에 불가역적으로 결합하거나 생체분자에 대한 접근용이성이 감소할 가능성이 있다. 따라서 칩 위에서의 생체분자 효소 분해에 대한 조건들이 최적화 될 필요성이 있고 여러 가지 조건들을 통해 최적화되었다. 모델 단백질로 선택한 것 중에서 BSA, lysozyme 그리고 cytochrome C이 칩 상에서의 효소 분해가 잘 되었고 BSA와 lysozyme의 경우는 100 ~ 150 fmol의 농도에서도 가능하였다. BSA의 경우는 단독으로 있을 경우와 혼합물 속에 있을 경우 모두 칩 상에서의 효소 분해가 잘 되었음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들을 바탕으로 칩 상에서의 생체 분자 효소 분해와 질량분석기를 통한 기술이 향후 프로테옴 분석 분야에서 대량 분석 시스템으로서의 사용이 가능할 것이다.
