Mammalian poly(A) polymerase (PAP), a key enzyme in the pre-mRNA 3`-end processing reaction, carries the catalytic domain in the N-terminal region, an RNA binding domain, two nuclear localization signals, and a serine/threonine-rich regulatory domain in the C-terminal region. Since the poly(A) tail is implicated in stability, nuclear export, and translation efficiency of mRNA, the control of the poly(A) tail addition by PAP could be an important mechanism that regulates the level of the gene expression. The PAP activity can be regulated through interaction between PAP and regulatory proteins. In order to determine whether these regulatory proteins exist and how they regulate the PAP activity, partner proteins that would interact with the C-terminal region of PAP were searched using yeast two-hybrid screenings. The 25-kD subunit of cleavage factor I (CFI-25), 14-3-3ε, and cyclophilin were identified as candidate proteins that bind to the C-terminal region of PAP: 1) The glutathione S-transferase-pull down assay and the immunoprecipitation experiment revealed that PAP directly interacts with CFI-25 and that the C-terminal 69 residues of PAP and the N-terminal 60 residues of CFI-25 are sufficient for the interaction between CFI-25 and PAP. Since CFI is known to function in the assembly of the pre-mRNA 3`-processing complex, this interaction may play an important role in the assembly of the processing complex and/or in the regulation of PAP activity within the complex. 2) 14-3-3ε, a signaling protein identified as a discrete phosphoserine/threonine binding module, inhibited PAP by interacting with the C-terminal region of PAP. This interaction was dependent on PAP-phosphorylation. Overexpression of 14-3-3ε also led to the shorter length of poly(A) tails of mRNA in vivo. PAP and 14-3-3ε was co-localized in cytoplasm of cotransfected cells. These data suggested a potential role for 14-3-3ε in modulating PAP activity through a phosphorylation-dependent interaction. This modulation can be achieved by a direct interaction between 14-3-3ε and PAP as well as by nuclear export of PAP to cytoplasm through interaction with 14-3-3ε. 3) Interaction of PAP with cyclophilin enhanced the PAP activity. Cyclosporin A that binds with high affinity to cyclophilin inhibited the PAP-cyclophilin interaction.
A mouse intronless gene, encoding a testis-specific poly(A) polymerase (PAPT), was previously identified. PAPT may play a role as a putative enzyme that is responsible for polyadenylation during mouse spermatogenesis. The about 100 residues at the C-terminal region of PAP are missing in PAPT. Some genes have different sequence specificity for polyadenylation site-selection in testis, compared to other tissue counterparts. Furthermore, the poly(A) tail length of some mRNAs varies during spermatogenesis. So it was proposed that there would be a testis-specific pre-mRNA 3`- end formation machinery. Although PAPT was identified, it is not known whether or not PAPT is functional in vivo. In this thesis, PAPT was expressed as a HA-tagged protein in NIH/3T3 cells and the recombinant protein was purified through HA-affinity chromatography. The recombinant protein showed a polyadenylation activity. However, PAPT efficiently polyadenylated RNA substrates only when a poly(A) tail was present at the 3` end. These results and the localization of PAPT in cytoplasm of testis suggest that PAPT plays an essential role in control of the poly(A) length of mRNA in the cytoplasm. The PAPT activity was also controlled by protein-protein interactions. 14-3-3ε inhibited the PAPT activity through interaction with PAPT, suggesting that 14-3-3ε modulates poly(A) synthesis in cytoplasm of testis. Since PAPT did not interact with CFI-25, which interacts with PAP as a component of the mammalian pre-mRNA 3…-end processing machinery, the polyadenylation mechanism by PAPT should differ from that of PAP. A Gal4-based yeast two-hybrid screening was performed to identify PAPT-interacting partner proteins that would be involved in the regulation of the PAPT function. One clone was found to encode adenosine deaminase (ADA). The GST-pull down assay and coimmunoprecipitation experiment confirmed that PAPT interacts with ADA. This interaction was down-regulated the PAPT activity. In contrast, ADA did not interact with PAP. A transient expression analysis showed that PAPT and ADA were co-localized within the cytoplasm of NIH/3T3 cells.
Taken together, this thesis work can provide molecular bases for understanding novel modes of global gene regulation through regulation of the PAP or PAPT activity.
포유동물에서의 유전자 발현은 다양한 기작에 의해 조절된다. 이런 조절 기작들 중에서 mRNA의 전사 후 가공 (post-transcriptional modification) 기작의 하나인 3’ 말단 RNA 가공과정은 mRNA의 안정성 및 번역 개시 (translation initiation)등과 연관되는 매우 중요한 유전자 발현 조절 기작이다. 유전자 발현 조절에서 3` 말단 RNA 가공과정은 그 자체가 매우 중요한 단계일 뿐 아니라 전사 (transcription)와도 매우 밀접하게 연결되어 있다. 3` 말단 가공과정 핵심효소인 폴리(A) 중합효소 (poly(A) polymerase, PAP)는 여러 조절 단백질들과의 상호작용으로 그 활성이 조절된다고 여겨지고 있다. 상호 작용하는 단백질들이 폴리(A) 중합효소의 활성을 조절하는지를 연구하기 위해, 폴리(A) 중합효소의 C-말단부위를 사용하여, yeast two-hybrid 선별과정을 수행하였다. 여러 가지 후보 단백질들 중, 특히 25 kDa subunit of Cleavage factor I (CFI-25), 14-3-3 epsilon (14-3-3ε), Cyclophilin 단백질들에 대한 연구를 수행하였다. 1) 3` 말단 mRNA 가공과정을 위해서는 RNA 절단반응 (cleavage)과 poly(A) 첨가반응 (addition)이 일어나야 하는데, 지금까지 RNA 절단반응에 관여하는 효소는 밝혀지지 않았었다. CFI-25가 RNA 절단반응과 poly(A) 첨가반응의 연결고리 역할을 한다는 것을 밝힘으로써 폴리(A) 중합효소가 절단반응에 직접적으로 관여한다는 증거를 제시하였다. 2) 세포내 신호전달과정에 관여하는 14-3-3ε 단백질이 폴리(A) 중합효소의 C-말단부위와 상호작용함으로써, 폴리(A) 중합효소의 활성이 저해되는 현상을 발견하였고, 그 상호작용은 폴리 (A) 중합효소의 인산화에 밀접하게 관련이 되어 있음을 알았다. 그리고, 14-3-3ε 단백질과 폴리(A) 중합효소의 복합체가 세포질에서 관찰이 되었다. 이러한 연구를 통하여, 14-3-3ε 단백질과의 상호작용으로 폴리(A) 중합효소의 세포내 위치 (localization) 와 그 활성이 조절된다는 중요한 결과를 얻었다. 3) Cyclophilin과의 상호 작용으로 폴리(A) 중합효소의 활성이 증가되었다. 또한, Cyclophilin과 강한 결합력을 가지는 Cyclosporin A이 폴리(A) 중합효소와 Cyclophilin과의 상호작용을 방해한다는 사실을 밝혔다.
생쥐의 정소분화단계에서 아데닐산 중합반응 (polyadenylation)을 수행하는 후보단백질인 정소특이적 폴리(A) 중합효소 (testis-specific poly(A) polymerase, PAPT)의 존재를 확인하였다. 정소특이적 폴리(A) 중합효소는 폴리(A) 중합효소에 비해 C-말단부위의 100개 아미노산 길이가 짧고, intronless 유전자이다. 몇가지 유전자들이 정소에서의 아데닐산 중합반응이 다른 기관과 다르게 발생한다는 보고와 정소특이적 폴리(A) 중합효소의 존재로 인하여, 정소특이적인 아데닐산 중합반응 기작의 가능성을 알 수 있다. HA-PAPT 단백질을 NIH/3T3 세포에서 발현을 하여 정제하고, 정소특이적 폴리(A) 중합효소 활성을 조사하였다. 정소 특이적 폴리(A) 중합효소는 세포질 (cytoplasm)에서 아데닐산 중합반응을 수행 할 수 있었고, 특히 3’ 말단영역에 다중 아데노신을 가지는 RNA에만 작용하였다. 정소특이적 폴리(A) 중합효소도 상호 작용을 하는 단백질들에 의하여 그 활성이 조절되었다. 정소특이적 폴리(A) 중합효소가 14-3-3ε 단백질과의 상호작용으로 그 활성이 저해됨을 보였다. 또한, 정소특이적 폴리(A) 중합효소는 CFI-25 단백질과는 상호작용하지 않았고, 이는 정소특이적 폴리(A) 중합효소의 아데닐산 중합반응기작이 폴리(A) 중합효소와는 다르다는 것을 알 수 있었다. 정소특이적 폴리(A) 중합효소의 기능을 조절하는 단백들을 연구해보고자 yeast two-hybrid 선별과정을 통하여, 여러 후보단백질들을 찾았다. 그 중, 아데노신탈아미노화효소 (adenosine deaminase, ADA)는 폴리(A) 중합효소와는 결합하지 않고, 정소특이적 폴리(A) 중합효소에만 특이적으로 상호작용을 하는 중요한 단백질이었다. 정소특이적 폴리(A) 중합효소는 아데노신탈아미노화효소와의 상호작용으로 그 활성이 조절되었고, 두 단백질의 결합체는 세포질에 존재함을 관찰할 수 있었다.
본 논문의 연구내용들은, 폴리(A) 중합효소와 정소특이적 폴리(A) 중합효소의 조절과정을 통한 유전자 발현의 새로운 기작에 대한 이해를 위한 분자생물학적 의미를 부여해 줄 수 있다.
