N-Carbamyl-D-amino acid amidohydrolase (N-carbamoylase), which is currently employed in the industrial production of unnatural D-amino acid in conjunction with D-hydantoinase, has low oxidative and thermal stability, and low expression. First, we attempted a simultaneous improvement of oxidative and thermal stability of N-carbamoylase from Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291 by directed evolution using DNA shuffling. In a second generation of evolution, best mutant 2S3 with improved oxidative and thermal stability was selected, purified, and characterized. Temperature, at which 50% of initial activity remains after incubation for 30 min was 73℃ for 2S3, while it was 1℃ for wild-type enzyme. Treatment of wild-type enzyme with 0.2 mM hydrogen peroxide for 30 min at $25℃ resulted in a complete loss of activity, but 2S3 retained about 79 % of initial activity under the same conditions. In addition, through the time course inactivation experiment, oxidative stability of the evolved enzyme 2S3 was about 18-fold higher than wild type at 0.2 mM $H_2O_2, and it also showed an 8- fold increased thermostability at 70℃. The Km value of 2S3 was estimated to be similar to that of wild-type enzyme; however $k_{cat}$ was decreased, leading to a slightly reduced value of $k_{cat}$ /Km compared to wild-type enzyme. DNA sequence analysis revealed that six amino acid residues were changed in 2S3, and substitutions included Q23L, V40A, H58Y, G75S, M184L, and T262A. Stabilizing effects of each amino acid residue were investigated by incorporating mutations individually into wild-type enzyme. Q23L, H58Y, M184L, and T262A were found to enhance both oxidative and thermal stability of the enzyme, and of them, T262A showed the most significant effect. Meanwhile, V40A and G75S gave rise to an increase only in oxidative stability. The positions of the mutated amino acid residues were identified in the structure of N-carbamoylase from Agrobacterium sp. KNK 712 and structural analysis of the stabilizing effects by each amino acid substitution was also carried out.
Second, we made an effort to increase the expression level of N-carbamoylase using error-prone PCR. Mutant library was constructed by N-terminally fusion of mutated gene to GFP and 5 fluorescent colonies were selected. From sole expression, Ex1 which showed the highest level of fluorescence of the enzyme was 3-4-fold increase in expression. DNA sequencing analysis revealed the substitutions of two amino acids, Val 40 and Thr262, to alanine in Ex1. Effect on the increase in expression by change of each amino acid was investigated by site-directed mutagenesis. Either V40A or T262A was additively improved not specific activity, but the expression of N-carbamoylase. Moreover, comparing the large amount of inclusion body production of wild type, the aggregate of V40A/T262A was almost vanished. Therefore, it seems that the increase in the level of heterogeneous expression of N-carbamoylase in E.coli resulted from the decrease in formation of inclusion body.
D-아미노산의 생산에 이용되는 효소인 N-carbamoylase의 산화적 안정성 및 열 안정성을 방향적 진화 기법을 이용하여 증진 시켰다. 임의의 돌연변이를 도입하기 위하여 DNA shuffling을 이용한 후, 여기서 얻어진 돌연변이 집단을 각각 열 처리 및 과산화 수소 처리하였다. 이때 남아있는 활성을 activity screening plate를 이용한 filter paper assay를 수행 함으로서 각 안정성이 동시에 증진된 돌연변이를 찾았다. 두 단계의 진화과정을 통하여 얻은 가장 안정성이 증진된 돌연변이인 2S3 는 wild type과 비교하여 열 안정성은 8배가 증진 되었으며, 산화적 안정성은 18배가 증진되었다. 2S3의 경우 6개의 아미노산의 변화를 보였는데, 23번의 글루타민이 류신으로 (Q23L), 40번의 발린이 알라닌으로 (V40A), 58번의 히스티딘이 티로신으로 (H58Y), 75번의 글리신이 세린으로 (G75S), 184번의 메티오닌이 류신으로 (M184L), 그리고 262번의 트레오닌이 알라닌 (T262A)으로 변하였다. Site-directed mutagenesis를 통하여 각 아미노산의 변화가 안정성의 증진에 어떻게 기여하였는가를 비교하였을 때, T262A의 경우 산화적 안정성 및 열 안정성 증진에 가장 크게 기여 하였으며, Q23L, H58Y, M184L, T262A의 경우는 산화적 안정성과 열 안정성이 동시에 증진한 반면, V40A와 G75S는 산화적 안정성 만이 증진 된 것을 알 수 있다. N-carbamoylase의 구조로부터 안정성 증진의 요인을 분석 하였을 때, 대부분의 경우 소수성 증가에 의하여 열 안정성이 증진됨을 알 수 있다.
두 번째로 대장균에서의 N-carbamoylase의 발현 증진을 유도하였다. Error-prone PCR을 통해 임의의 돌연변이를 도입한 후, 녹색 형광 단백질과 fusion 상태로 발현 시켰을 때, 형광을 띄고 있는 colony를 찾았다. 십만개의 colony중 얻어진 5개의 colony를 찾을 수 있었으며, 이중 가장 높은 형광을 띄고 있는 돌연변이인 Ex1은 녹색 형광 단백질이 붙어 있지 않은 상태로 발현 시켰을 때, 동일 조건의 wild-type에 비해 3-4 배 정도 발현량이 증진되었다. 아미노산의 변화를 조사하였을 때, 40번의 발린이 알라닌 (V40A) 으로 변화하였으며, 262번의 트레오닌이 역시 알라닌 (T262A) 으로 변화한 것을 알 수 있었다. 각각의 돌연변이를 site-directed mutagenesis를 통하여 도입하였을 때, V40A와 T262A 모두 발현이 증가 되었으며, 동시에 inclusion body의 형성이 감소 하였음을 알 수 있다. 두 변환을 동시에 도입하였을 때는 inclusion body의 형성을 보이지 않았다. 따라서, Ex1에서의 발현의 증가는 inclusion body 형성의 감소에 의한 것으로 생각된다.
