Functional salvage screen (FSS) method was invented as a novel method that could create new protein lineage with different sequence space. Functionally salvaged GFP variants with randomly inserted fragments were generated by FSS. However, these mutants showed little fluorescence intensity. Among these variants, GFP-I5 was selected and directly evolved to optimize the spectral property. As a result, best mutant, E-2S4 was obtained from the library generated by ep-PCR and DNA shuffling. It possessed the mutations in F64L, E111V, K166Q and Kins-8N residues. The fluorescence intensity of purified protein of E-2S4 was ~28-fold improved over that of GFP-I5, but other spectral properties were unchanged. This improvement of fluorescence was also observed in the whole cell of E.coli. Purified protein of E-2S4 has different conformation with other GFP mutants. In order to investigate the effect of each mutated residues on fluorescence intensity, site-directed mutagenesis was carried out. Site-specific mutations in other templates showed the different effect of fluorescence intensity. These results suggest that salvaged variant, GFP-I5 had new sequence space by the incorporation of 12 amino acids and it was subjected to new evolution pathway in further artificial evolution.
Functional salvage screen (FSS) 방법에 의해서 12개의 아미노산이 삽입되어 기능적으로 복원된 녹색 형광 단백질의 변이체 GFP-I5를 인위적인 방법을 통해서 진화시켰다. GFP-I5는 GFPuv에 비해서 약 4 %정도의 형광을 보이는데 이의 세기를 증가시키기 위해서 한 번의 error-prone PCR과 두 번의 DNA shuffling을 사용하였다. 각각의 방향적 진화 과정에서 얻어진 변이체의 집합체로부터 높은 형광 세기를 보이는 돌연변이체를 선별하여, 다음 단계의 방향적 진화 방법에 적용하는 방법으로 형광 세기가 증가된 변이체 E-2S4를 찾았다. 이는 F64L, E111V, K166Q, Kins-8N 아미노산에서의 돌연변이가 있었으며, 이 돌연변이체로부터 녹색 형광 단백질을 affinity chromatography를 이용해서 분리하여 spectrofluorometer를 사용하여 형광 세기를 측정한 결과 약 112 %의 값을 보였다. 이는 GFP-I5에 비해서 약 28배 증가된 값이다. 이러한 결과는 세포 수준에서의 형광 세기에서도 마찬가지로 일어난다는 사실도 확인할 수 있었다. 또한, 분리된 녹색 형광 단백질들은 maltose binding protein (MBP)와 결합된 상태에서 그 값 들을 측정하였는데, MBP가 없는 상태에서도 비슷한 값을 나타내는 것으로 볼 때 MBP는 녹색 형광 단백질의 형광 세기에 별로 영향을 미치지 않는다는 사실도 확인했다. 이러한 돌연변이에 의한 형광 세기 향상의 작용을 이해하기 위해 native PAGE analysis와 site-directed mutagenesis study를 수행하였다. 이를 통해서 형광 세기가 향상된 돌연변이체 E-2S4가 다른 녹색 형광 단백질 변이체들과는 다른 conformation을 가지고 있다는 것을 확인하였다. 또한, 특수 부위 돌연변이의 영향 조사에 의해서 각각의 아미노산 변화가 형광 세기 증가에 크게 기여하지 않고, 전체적인 변화에 의해서만 형광이 증가된다는 사실과 각각의 templates에 대해서 다른 영향을 보인다는 사실에 의해 아미노산이 삽입되어 만들어진 GFP-I5가 형광 증가의 과정에서 다른 진화 과정을 거쳤을 것으로 예측되며, 이러한 사실은 FSS가 새로운 서열 공간을 가진 단백질을 만들 수 있고, 이 방법에 의해서 기능적으로 복원된 단백질 변이체가 인위적인 방향적 진화에서 다른 진화 과정에 의해서 목적 형질이 향상될 수 있다는 가능성을 제시한다.
