Liprin-α /SYD-2 is a protein known to regulate presynaptic structure and directly interact with the LAR family of receptor tyrosine phosphatases (RPTP) and the GRIP/ABP family of PDZ proteins. Here I study that liprin-α directly interacts with GIT1, a GTPase-activating protein for a small GTP-binding ADP-ribosylation factor (Arf) that is known to regulate protein trafficking and actin cytoskeleton. GIT1 also directly binds to focal adhesion complex (FC) proteins including β-Pix/Cool rac1 GTP exchange factor, focal adhesion kinase (FAK) and paxillin. GIT1 is broadly expressed in rat brain slices. GIT1 is also colocalized with liprin-α and GRIP at both excitatory and inhbitory synaptic sites in hippocampal cultured neurons. GIT1, β-PIX , Pyk2, and FAK but not paxillin are tightly associated with the postsynaptic density along with liprin-α in rat brain. GIT1 was coimmunoprecipitated with liprin-α, β -PIX, FAK and Pyk2, and a GIT1 fusion protein pulled down liprin-α, GRIP and AMPAR in rat brain. Interestingly, disruption of the interaction between GIT1 and liprin-α by a dominant negative construct significantly decreased synaptic clustering of liprin-α, GRIP and AMPA receptor (AMPAR) in hippocampal cultured neurons. Also it was also found that GIT1 could be a potential substrate for the LAR family of receptor protein tyrosine phosphatase(RPTP) in vitro.
These results suggest that GIT1 may modulate the synaptic clustering of AMPAR by interacting with liprin-α/GRIP complex, and that GIT1 may regulate protein trafficking and actin cytoskeleton at synaptic sites by interacting with Arfs and the LAR family of RPTPs.
ARF는 plasma membrane과 vesicle 사이의 trafficking과 cytoskeleton 조절에 중요한 단백질로 알려져 왔다. 본 연구에서는 ARF의 기능을 조절하는 것으로 보고된 GAP 단백질중 GIT1이 focal adhesion site로 receptor protein tyrosine phosphatase로 알려진 LAR이란 단백질을 recruitment시키는 것으로 제시된 liprin-α와 상호작용한다는 사실을 여러가지 실험적인 증거들을 제시하고 그것의 생물학적 기능을 밝혔다. liprin-α는 최근, AMPA receptor의 시냅스 이동에 중요하다고 생각되어지는 GRIP/ABP 단백질과 결합하는 것이 보고되었는데, 본 연구에서는 liprin-α의 downstream 단백질들을 밝히고자 시행한 yeast two hybrid screen을 통해서 GIT1과 상호작용한다는 사실을 밝혔다. Yeast two hybrid assay와 in vitro coimmunoprecipitation, in vivo pulldown, in vivo coimmunoprecipitation, in vitro colocalization assay 등을 통해서 상호작용함을 밝혔다. 또한 본 연구에서는 GIT1은 뇌의 다양한 부분에서 발현되며, PSD에 강하게 enrichment되어 있으며, 이와 더불어 focal adhesion에 존재하는 다양한 단백질들이 PSD에 존재하고 있음을 밝혔다. GIT1은 cultured hippocampal neuron에서 axon, dendrite에 모두 분포하며, excitatory synapse와 inhibitory synapse에 모두 존재함을 광학현미경상에서 관찰하였다. 두 단백질의 상호작용의 기능을 알아보기 위해서 cultured hippocampal neuron에서 dominant negative approach를 시행한 결과, AMPA receptor의 targeting을 선택적으로 disruption 시켰다. 이는 두 단백질이 PSD에서 AMPA receptor의 targeting을 조절하는 데 있어서 매우 중요함을 제시하는 것이다. 아울러서, axon growth cone guidance에 중요하다고 알려진 LAR의 substrate로서 GIT1을 밝혔다. AMPA receptor와 LAR의 시냅스에서의 중요성을 고려해볼 때, 본 연구는 시사하는 바가 크다고 생각된다.
