Transcriptional sequencing reaction for mass spectrometry analysis was compared using wild type and Y639F, F644Y, Y639F/F644Y mutant T7 RNA polymerases. Because 3´-dGTP, 3´-dUTP and 3’-dCTP except 3´-dATP were not commercially available, transcriptional sequencing with 300uM of GTP, ATP, UTP and 2´-dCTP as elongating nucleotide and 2mM 3’-dATP, 1mM ddGTP, 2mM ddATP, 0.5mM ddTTP and 0.2mM ddCTP as terminating nucleotides on linear and circular DNA template was performed using mutant T7 RNA polymerases. Transcription activity were 260.04 unit/㎍ for wild type, 194.12 unit/㎍ for Y639F, 193.8 unit/㎍ for F644Y, and 44.36 unit /㎍ for double (Y639F/F644Y) mutant T7 RNA polymerase. The order of sequencing reaction with 3´-dATP was Double (Y639F/F644Y) ＞ Y639F ＞ F644Y ＞ WT between 20 to 50 mer for circular DNA template and Double ＞ F644Y ＞ WT ＞ Y639F between 20 to 50 mer for linear DNA template. Double mutant had better transcriptional sequencing activity with 3´-dATP than wild and Y639F, F644Y mutants. Wild type and F644Y, Double mutant had non-specific termination but Y639F mutant can incorporate ddNTPs on circular DNA template. Y639F mutant can use ddNTPs on linear DNA template but wild type and F644Y, double mutant can not incorporate ddNTPs. Y639F had good transcriptional sequencing ability with 2´-dCTP as elongating nucleotide for better mass resolution between U and C and with ddNTPs instead of 3’-dNTPs as terminating nucleotides. This strategy will help for the development of mutant T7 RNA polymerases with high specificity and transcription activity for mass spectrometry analysis.
Wild type T7 RNA 중합효소와 함께 T7 RNA 중합효소의 돌연변이인 Y639F, F644Y, double(Y639F/F644Y) T7 RNA 중합효소의 전사과정을 이용해 질량 분석법을 위한 전사 염기 서열결정 반응을 비교하였다. 이미 확립된 Y639F T7 RNA 중합효소 돌연변이를 이용한 전사 염기 서열 결정 반응의 최적 조건과 동일하게 전사 연장자로 300uM의 GTP, ATP, UTP, 2′-dCTP를 전사 종결자로 2mM 3′-dATP, 1mM ddGTP, 2mMdd ATP, 0.5mM ddTTP를 사용했다. T7 RNA polymerase들 중 wild type이 260.04 unit/㎍의 activity를 나타내었고, Y639F과 F644Y는 wild type의 약 75%, double mutant는 wild type의 17% activity를 나타냈다. 먼저 circular template로 3′-dATP를 전사 종결자로 사용했을 때의 RNA 전사물은 20 mer에서 50mer 사이에서 Double Y639F ＞ F644Y ＞ WT 순으로 잘 만들어 졌고, linear template를 이용해 3′-dATP를 전사 종결자로 사용했을 때는 20mer 와 50mer 사이에서 Double ＞ F644Y ＞ WT ＞ Y639F 순이었다. Circular DNA template와 전사 종결자로 ddNTP를 사용했을 때는 wild type과 F644Y, double mutant 는 non-specific termination만 일어났고, Y639F만 ddNTP를 사용할 수 있었다. linear DNA template를 사용했을 때도 역시 Y639F 만 ddNTP를 사용했고, wild type, F644Y, double mutant는 전혀 ddNTP를 사용하지 못했다. 앞으로 질량분석을 통한 염기서열결정에 이용할 더 좋은 mutant T7 RNA polymerase 발굴에 필요하다.
