I have developed a method for fabricating DNA microarrays that use a codon scanning algorithm to design oligonucleotide probes and pin spotting to immobilize 3’-terminal-aminated oligonucleotides on a glass surface. The oligonucleotides are covalently attached to the glass surface by a 3’ amino-linker that reacts with the aldehyde group on the glass surface. Using this method, I fabricated DNA chips that can detect 16 mutations containing all reported Korean substitution mutations in Wilson disease. These mutations were successfully detected with fluorescently labeled synthetic oligonucleotide reporters. Furthermore, three normal persons and nine Wilson disease patients were successfully diagnosed by hybridization of the PCR products obtained from the selected regions of genomic DNA. This research provides a simple, economical, rapid and efficient method for DNA chip production using the synthesized oligonucleotide.
유전질환인 윌슨씨 병의 진단을 위해, 유전질환 데이터베이스를 이용하여 검색한 기능성 단백질 단편(Functional motif) 상에 자주 발생하는 교환(Substitution) 돌연변이와 한국인 또는 서양인에게서 호발하는 교환 돌연변이를 검색할 수 있는 DNA 칩 시스템을 제작하였다. 기능성 단백질 단편에서 인산과 반응하는 영역(Phosphate domain), ATP와 결합하는 영역(ATP binding domain)과 힌지 부위(Hinge region)의 세 부위에 보고된 총 12가지의 교환 돌연변이와, 서양인에게서 호발하는 하나의 돌연변이, 한국인에게 발생하는 네 가지 교환 돌연변이를 모두 포함, 16가지의 돌연변이를 검색하였다. 여섯 쌍의 중합효소연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction) 프라이머를 설계하여 위 16 가지의 돌연변이 영역을 증폭하였고, 위 반응이 동시에 일어날 수 있도록 동시 증폭(multiplex PCR) 조건을 확립하였다. 돌연변이 영역의 검색은 지정된 돌연변이를 포함하는 연속된 세 개의 염기를 코돈으로 지정하고 이를 검색하는 코돈 검색 알고리즘을 이용하였다. 염기의 종류에 따라 결합정도의 차이를 보기위해 15mer의 DNA 단편(Oligonucleotide)에서 8번째 위치에 모든 가능한 경우를 삽입하였고, DNA 단편의 3` 말단에 아민기(Amine residue)를 가지게 하여 알데하이드기(Aldehyde residue)를 입힌 유리판 위에 고정화 할 수 있게 하였다. 마지막으로 중합효소연쇄반응으로 증폭된 영역과 DNA 단편 사이의 서로 특이적 상보결합이 이루어질 수 있는 조건(Hybridization condition)을 확립하여 정상인과 윌슨씨 병 환자의 진단에 적용하여 성공적인 진단을 수행하였다.
