It is demonstrated here that a DNA segment can be sequenced by transcription reactions of the Y639F mutant T7 RNA polymerase. Addition of 2'-deoxyribonucleoside 5'-triphosphate (dNTP) and 2', 3'-dideoxyribonucleoside 5'-triphosphate (ddNTP) instead of ribonucleoside 5'-triphosphate (NTP) and 3'-deoxyribonucleoside 5'-triphosphate (3'-dNTP) in the standard transcription reactions produce sets of base-specifically terminated transcripts. The conditions for the transcriptional sequencing reactions with Y639F mutant RNA polymerase were optimized for higher yields of transcripts. The optimum concentrations of terminating nucleotides (ddNTP) and elongating nucleotides (GTP, ATP, UTP, dCTP) were different for different sizes of RNA. The higher concentration of terminating nucleotide or the lower concentration of elongating nucleotide was, the more the shorter transcripts but the less the longer transcripts were produced. The order of the optimum ratio of "terminating nucleotide concentration" to "elongating nucleotide concentration" for higher yield of RNA transcripts was ddATP/ATP>ddGTP/GTP>ddTTP/UTP>ddCTP/dCTP, which was comparable to the relative selectivity of Y639F mutant for 3'-dNTP and NTP (3'-dATP/ATP<3'-dGTP/GTP, 3'-dUTP/UTP<3'-dCTP/CTP). This strategy would help difficulties arise due to the small mass difference (1Da) of U and C, and commercially not available 3'-dNTP, so that it can contribute to the mass spectrometric analysis of a single-tube transcription reaction for DNA sequencing.
박테리오파지 T7 RNA 중합효소의 돌연변이인 Y639F T7 RNA 중합효소의 전사과정에 의해 DNA 염기서열결정이 가능하다. 일반적으로 사용하는 전사연장자인 NTP 대신 dNTP를 이용하고 일반적인 전사종결자인 3'-dNTP 대신 ddNTP를 이용한 전사반응을 통해 특정 염기로만 종결된 RNA 전사체들을 얻었다. 보다 많은 양의 전사체들을 얻기 위하여 Y639F 돌연변이를 이용한 염기서열 결정용 전사반응의 조건을 최적화하였다. 최적의 ddNTP 농도 및 GTP, ATP, UTP, dCTP의 농도는 전사체의 길이에 따라 다르게 나타났다. 전사종결자의 농도가 높을수록, 또는 전사연장자의 농도가 낮을수록 짧은 전사체들은 많이 생성되는 반면 긴 전사체들은 덜 생성되었다. 많은 전사체를 만들기 위한 전사종결자 농도 대 전사연장자 농도의 최적비율의 순서는 ddATP/ATP>ddGTP/GTP>ddTTP/UTP>ddCTP/dCTP로 Y639F 돌연변이의 3'-dNTP와 NTP에 대한 상대적인 선택성(3'-dATP/ATP<3'-dGTP/GTP, 3'-dUTP/UTP<3'-dCTP/CTP)과 부합하는 경향을 나타냈다. 이처럼 시판되지 않는 3'-dNTP 대신 ddNTP를 이용하고 U와 C의 질량차이를 늘림으로써, 질량분석을 이용한 염기서열결정에 도움이 될 것이다.