In the PART1, cellular responses of metabolically engineered Escherichia coli to the accumulation of poly(3-hydroxybutyrate)[PHB] were analyzed at the protein level. Physiological variations, when PHB accumulating cellular event occurs in recombinant Escherichia coli, were sxamined by 2-dimensional gel electrophoresis. Out of 20 proteins showing altered expression levels with the accumulation of PHB, 13 proteins were identified with the aid of mass spectrometry. Three heat shock proteins, GroEL, GroES and DnaK, were up-regulated in PHB accumulating cells. Proteins which play essential roles in protein biosynthesis were unfavorably influenced by the accumulation of PHB. Cellular demand for the large amount of acetyl CoA, from which PHB biosynthesis pathway begins. resulted in the increased expression of two enzymes of glycolytic pathway. Amino acid starvation was observed in PHB accumulating cells as evidenced by the kncreased expression of relB. a negative regulator of translation. A protein(Dps) known to protect DNA during starvation was up-regulated in PHB accumulating cells. The expression of yfid gene encoding the 14.3kDa protein in SRMB UNG intergenic region was greatly induced with the accumulation of PHB. These variations of proteome expression indicate the cellular responses to maintain the viability against the heterologous PHB accumulation.
physiological changes of Escherichia coli during the high cell density cultivation were characterized in PART Ⅱ. Overall cellular proteomes prepared at the different stage of high cell density cultivation were separated by 2-dimensional gel electrophoresis(2-DE), and differently expressed 15 proteins were identified using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS). When bacterial cells grew to high cell density. expression level of overall cellular proteins was decreased. According to functions in the cell, identified proteins were classified into three groups, proteins involved in transport process, small molecule metabolism, and synthesis and modification of macromolecules. Expression of proteins that play the essential roles in the process for the synthesis and modification of macromolecules decreased with the increase of cell density. Inhibition of DNA synthesis was observed when cells grew to high density, as evidenced with the increase expression of inorganic pyrophosphatase.
poly(3-hydroxybutyrate)[PHB]를 합성하도록 대사공학적으로 개량된 대장균이 PHB를 생산할 때 세포 내에서 일어나는 변화와 고농도로 배양된 대장균에서 일어나는 세포 내의 샐리학적 변화를 단백질 단계에서 분석하였다.
재조합 대장균 내에 PHB가 축적될 때의 변화를 2차원 전기 영동을 통해 전체 단백질의 발현 양의 차이를 통해 나타내었고, PHB 를 합성할 때 발현 양의 변화를 보이는 20개의 단백질 중에 13개를 MALDI-TOF 질량분석기를 통해 규명하였다. GroEL, GroES 그리고 DnaK의 heat shock protein들은 세포 내에 PHB가 축적되면서 발현 양이 증가 되었으며, 단백질 생합성에 깊숙이 관여하는 단백질들은 PHB합성으로 인해 세포 내 발현 양이 줄어 들었다. PHB 합성을 위해 과량으로 필요한 acetyl-CoA를 만들기 위해 glycolysis pathway에 관여하는 2개 효소의 발현 양이 증가 되었다. PHB를 축적하는 재조합 대장균에서는 amino acid starvation 현상이 관찰되었고, 이는 relB gene의 과다 발현으로 증명 되었다. DNA protection 에 관여하는 단백질인 Dps는 PHB를 축적하는 재조합 대장균에서 발현이 증가되었고, 아직 정확한 기능이 밝혀지지 않은 14.3 kDa protein in SRMBUNG intergenic region 은 PHB가 합성되는 재조합 대장균에서 가장 큰 발현의 증가를 보였다.
고농도로 배양된 대장균에서는 발현되는 단백질의 양과 수가 전체적으로 감소하였다. MALDI-TOF 질량준석기로 15개의 발현 양의 차이를 보이는 단백질을 규명하였고, 이를 세포 내의 기능에 따라 transport에 관여하는 단백질, small-molecule metabolism 에 관여하는 단빅질, 생체 고분자의 합성과 변환에 관여하는 잔백질의 3부류로 구분하였다. 고종도로 배양된 세포에서는 생체 고분자의 합성과 변환에 관여하는 단백질들의 발현이 현저히 감소 하였으며, DNA의 합성 또한 저해 되었다.
