Serratia marcescens metalloprotease inhibitor (SmaPI) is a proteinase inhibitor toward Serratia marcescens metalloprotease (SMP). The structure of SmaPI-SMP complex was not determined. However, the crystal structure of SMP-Erwinia chrysanthemi inhibitor was elucidated. The N-terminal sequence of E. chrysanthemi inhibitor is highly homologous to SmaPI. Therefore, the three dimensional structure of SmaPI-SMP complex was simulated by computer-modelling. Interestingly, the pocket around Ser-2 residue of SmaPI in the complex has enough space to be occupied by bulky side chain amino acids such as Phe and Tyr. To elucidate the roles of side chain of Ser-2 and the pocket in the complex, Seven point mutations at Ser-2 residue were introduced by site directed mutagenesis. Both of two mutants (S2K and S2D) showed very decreased inhibitory activities. A S2N mutant had a slightly decreased inhibitory activity. Four mutants (S2F, S2Y, S2A and S2V) had similar inhibitory activities compared with wild type. To investigate the role of a conserved disulfide bond in serralysin family inhibitors, we introduced two mutations (C24S and C47S) in SmaPI and expressed two mutant proteins in various versions of multiple-protease deficient B. subtilis DB431, WB600, and LB700. The substantial expression level of wild type SmaPI was maintained in the strains of B. subtilis, surprisingly, two mutants (C24S and C47S) were trivially expressed in lower versions of B.subtilis DB431 and WB600, however, substantially expressed in wprA-deficient B. subtilis LB700. In addition, the thermostability of two mutants (C24S and C47S) was monitored, the inhibitory activities of the mutants was dramatically decreased in boiling condition.
In summary, N-terminal hydrophobicity of SmaPI is important in the inhibitory activity and a disulfide bond in SmaPI contributes to not only its thermostability but also protease-resistant conformation.
Serratia marcescens의 Metalloprotease 억제제 (SmaPI)는 Serratia marcescens의 Metalloprotease(SMP)에 특이적으로 결합하여 그 활성을 억제하는 단백질이다. SMP와 SmaPI의 복합체의 3차구조는 결정되지 않았으나 Erwinia. chrysanthemi의 억제제와 SMP 복합체의 3차구조는 결정되었다. E. chrysanthemi의 억제제의 N 말단서열과 3차구조는 SmaPI와 매우 유사하다. 그러므로, SMP와 SmaPI 복합체의 3차구조를 computer simulation하였다. 흥미롭게도 이 복합체에서 SmaPI의 Ser-2 잔기의 side chain의 역할들을 밝히기 위해서 Ser-2 위치에 부위특이 돌연변이 기법을 이용해서 7개의 돌연변이를 도입했다. 두 개의 돌연변이체 (S2K, S2D)는 상당히 감소된 억제활성능을 가졌다. S2N 돌연변이체는 약간 감소된 저해활성능을 가졌다. 4개의 돌연변이체(S2F, S2Y, S2A, S2V)는 야생형과 거의 유사한 억제능을 가졌다.
Serralysin 억제제들 사이에 있어서 공통된 disulfide결합의 역할을 규명하기 위해서 SmaPI에 두 개의 돌연변이를 도입했고 (C24S, C47S), 두개의 돌연변이 단백질을 단백질 가수분해효소가 결손된 Bacillus subtilis DB431, WB600과 LB700에서 발현시켰다. 야생형 SmaPI의 상당한 발현양은 여러가지 Bacillus subtilis 균주에서 차이가 없었다. 그러나, 놀랍게도 Disulfide결합이 없는 두 개의 돌연변이체 (C24, C47S)는 wprA가 있는 Bacillus subtilis DB431과 WB600인 균주에서는 미미하게 발현되었으나, wprA가 결손된 Bacillus subtilis LB700에서는 발현양이 증가되었다. 또한, 이 두 개의 돌연변이체 (C24, C47S)의 열안정성을 관찰한 결과, boiling 조건에서는 상당히 감소하였다. 요컨대, SmaPI의 N-말단의 hydrophobicity가 저해능에 있어서 중요하고 SmaPI에서의 disulfide 결합이 열안정성뿐만 아니라 단백질 가수분해효소의 작용을 저해하는 구조를 유지하는데 기여할 것이라 사료된다.
