STATs (signal transducers and activators of transcription) are transcription factors that contain SH2 domains and are activated by tyrosine phosphorylation in response to cytokines and growth factors. Replication protein A (RPA) is a heterotrimeric complex that consists of three subunits, p70, p32 and p11, and has important functions in DNA replication and metabolism. Here, I present evidence that the RPA p32 subunit specifically binds to the SH2 domain of STAT3 in a phosphotyrosine-independent manner. I confirm their protein-protein interactions by yeast 2-hybrid analyses and in vitro binding assays using recombinant proteins generated from bacteria and in vitro translation. I also show that STAT3 binds to RPA p32 in vivo by conducting co-precipitation experiments. As the SH2 domain is highly involved in the tyrosine phosphorylation and the transcriptional activity of STAT3, over-expression of RPA p32 correspondingly augmented growth factor-stimulated tyrosine phosphorylation and transcription activities of STAT3.
STAT은 cytokine이나 성장요소에 반응하여 활성화 되는 전사 요소이다. STAT 전사 요소는 보존된 SH2 부분을 가지고 있으며, receptor tyrosine 인산화 효소나 jak이라는 cytosolic tyrosine 인산화 효소에 의해 tyrosine residue가 인산화 됨으로써 자신들끼리 dimerization을 하여 핵 내로 들어간 후 전사 활성을 나타낸다. Replication protein A는 한 가닥의 DNA에 특징적으로 결합하는 단백질로서 DNA 복제, 수정, recombination에 관여한다. 그리고 RPA는 p70, p32, p11과 같은 3가지의 요소들로 이루어져 있는 복합 단백질이다. 또한 RPA는 DNA 복제에 있어서 시작부분과 연장부분에 꼭 필요하고, 다른 세포 단백질과 결합함으로써 세포 내에서 많은 조절 기능을 한다. yeast 2-hybrid screening을 이용하여 STAT3 전사 요소의 SH2 부분에 RPA p32가 결합하는 것을 알 수 있었다. 이 결합을 확인하기 위해서 transfection을 이용하여, 세포내에서 인위적으로 발현시킨 RPA p32 단백질이 인위적으로 발현시킨 STAT3와 세포내의 STAT3 단백질 모두에 각각 결합하는 것을 확인하였다. 그리고 또한 STAT의 결합 부분을 검증하기 위하여 in vitro binding assay을 수행하여 SH2 부분에 결합하는 것을 확인하였다. RPA p32가 STAT의 활성에는 어떻게 영향을 미치는지 알아보기 위해 STAT의 활성에 가장 중요한 역할을 하는 tyrosine인산화와 전사 활성의 변화를 알아보았다. RPA p32를 과도하게 발현시킨 세포의 STAT에는 그렇지 않은 세포보다 tyrosine인산화가 더 많이 되어 있었고, STAT의 전사 활성도 2.5배 정도 더 올라가는 것을 확인할 수 있었다. 요컨데, RPA p32는 STAT의 SH2부분에 결합하여 tyrosine 인산화를 올림으로서 전사활성을 조절함을 알 수 있었다.
