Acid ceramidase (EC 3.5.1.23) is a lysosomal enzyme that hydrolyses ceramide to sphingosine and fatty acid. Ceramidase is supposed to be a key regulator in sphingosine generation and ceramide degradation, both of which are known as intracellular second messengers. Using the reported human acid ceramidase sequence (hAC), we tried to find any related sequence from database. Computer-assisted database search of sequences homologous to hAC revealed a 1,233 bp sequence (previously designated as cPj-LTR) which encoded a 266 amino acid open reading frame that was ~36% identical to this lysosomal enzyme. Based on this high degree of homology, we started this study to characterize the sequence further. From placenta cDNA library screening, cDNA clones were isolated and sequenced, and then renamed it as hACH for human acid ceramidase homologous sequence. The full-length hACH cDNA was 1,825 bp and contained an open-reading frame encoding a 359 amino acid polypeptide that was 33% identical and 69% similar to the hAC polypeptide over its entire length. Numerous short regions of complete identity were observed between these two sequences and two sequences available from the C. elegans genomic database. Northern blotting experiments revealed a major 2.0 kb hACH transcript that was expressed at high levels in the liver and kidney, but at relatively low levels in other tissues such as the lung, heart, and brain. Glycosylated flag/hACH, hACH/myc and hACH/GFP fusion proteins (48, 52 and 74 kDa, respectively) was expressed in COS-1 cells and found to be localized in perinuclear and cytoplasm showing punctuated pattern. Treatment of the fusion protein with peptido-N-glycosidase F reduced the molecular weights to 39, 42.5 and 64 kDa. Using an assay system employing fluorescently conjugated bodipy-ceramide (C12) as a substrate, hACH did not express ceramidase activity. Fast-atom bombardment (FAB) mass spectrometry revealed that hACH expression in COS-1 cells changed the lipid contents to some degree, which suggests that hACH may involved in lipid metabolism. GST/hACH fusion proteins were express in E. coli DH5α but most of the expressed proteins were precipitated as inclusion bodies. Genomic clones were isolated from human genomic library screening, and analyzed by sequencing and southern hybridization. The 30 kb long hACH genomic sequence contained 11 exons which ranged in size from 26 to 671 bp and 10 introns, which ranged from 150 bp to 6.4 kb. The gene was localized to the chromosomal region 4q21.1 by fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis. Sequence analysis of the 5'-flanking region of hACH gene revealed a putative promoter region that lacked a TATA box and was GC rich, typical features of a housekeeping gene promoter, as well as several tissue specific and/or hormone induced transcription regulatory sites. 5'-deletion analysis using luciferase reporter system revealed promoter activity to a 1.1 kb fragment within this region. A major transcription start site was located 72 bp upstream from the ATG translation initiation site by primer extension analysis. In this study, we cloned a novel gene homologous to AC and showed that the encoded protein, hACH was at least involved in lipid metabolism. Analysis of this novel protein, hACH could facilitate understanding of lipid metabolism and possibly lipid-mediated intracellular signaling.
Acid Ceramidase (EC 3.5.1.23) 는 라이소좀에 있는 효소로서 세라마이드 (ceramide)를 분해하여 스핑고신(sphingosine)과 지방산으로 만든다. Ceramidase는 세포내 신호전달 물질로 알려진 세라마이드와 스핑고신의 대사에 관여하는 중요한 조절자로 여겨지고 있다. 사람 Acid ceramidase (hAC) 염기서열을 이용하여 데이터베이스에 이와 관계가 있는 염기서열이 있는지 조사해 보았다. 컴퓨터를 이용하여 hAC와 유사한 서열을 가지는 유전자를 검색한 결과 cPj-LTR 이라고 명명된 1,233 bp의 DNA 서열을 얻을 수 있었다. 이 DNA 염기서열은 266 개 아미노산을 코딩하고 있었고, hAC와 36% 똑같은 서열을 가지고 있었다. 이러한 높은 유사성에 근거를 두고 이 DNA 서열을 더 연구하고자 하였다. 사람 태반 cDNA 라이브러리 스크리닝을 통하여 cDNA 클론을 분리하고 염기서열 분석을 수행하였다. 새로이 클론한 이 유전자를 hACH (human acid ceramidase homologous sequence)라고 새로이 명명하였다. 이 hACH cDNA는 1,825 bp 였고, hAC와 33% 동일하고 69% 유사한, 359 개의 아미노산을 코딩하고 있었다. 사람과 생쥐의 acid ceramidase, hACH 그리고 두 개의 C.elegans protein (K11D2.2 and F27E5.1) 아미노산 서열을 배열시켜 본 결과 이들의 서열이 전체적으로 보존되어 있음을 알 수 있었다. Northern blot 실험을 통하여 2.0 kb 정도의 mRNA transcript가 간과 콩팥에서 많이 발현되고 폐, 심장, 그리고 뇌에서는 비교적 적게 발현됨을 알 수 있었다. Glycosylation된 flag/hACH, hACH/myc 그리고 hACH/GFP 융합 단백질을 (48, 52 그리고 74 kDa) 포유동물세포에서 발현시켰고 이들이 핵 주변과 세포질에 여러 개의 반점과 같은 양상으로 위치함을 확인하였다. 이 단백질들이 glycosylation 되어 있음을 Peptido-N-glycosidase F라는 효소처리를 통하여 분자량이 감소함을 (각각 39, 42.5, 64 kDa이 됨) 확인함으로써 알 수 있었다. 형광물질이 붙어있는 bodipy-ceramide (C-12)를 기질로 사용한 활성실험에서 hACH가 ceramidase 활성이 있음을 확인 할 수는 없었다. 하지만 hACH를 과다 발현시킨 세포의 지질을 Fast-atom bombardment (FAB) mass spectrometry를 이용하여 분석한 결과 여러 종류의 지질의 양에 변화가 생겼음을 알 수 있었다. 이것은 적어도 hACH 단백질이 지질 대사과정에 관여함을 보여주는 것이었다. GST/hACH 융합 단백질을 대장균에서 발현 시켰으나 대부분 inclusion body 형태로 침전되었다. 사람 게놈 라이브러리 스크리닝을 통하여 사람 게놈 클론을 분리하였고 염기서열 분석과 southern blot을 이용하여 이들의 구조를 연구하였다. 사람 게놈클론은 30 kb에 걸쳐 있었고 26 bp 에서 671 bp 크기로 된 11개의 exon과 150 bp 에서 6.4 kb의 크기로 된 10의 intron으로 이루어져 있음을 알 수 있었다. 이 유전자는 사람 게놈 4q21.1 에 위치함을 fluorescent in situ hybridization (FISH)를 통하여 알 수 있었다. HACH 유전자의 5'쪽 근접 부분의 염기서열을 분석함으로써 TATA-box가 없지만, G+C 가 많은 프로모터로 예상되는 부분이 있음을 확인할 수 있었다. 이 부분에는 몇 가지의 조직특이적 전사 조절 부위와 호르몬에 의해 유도되는 전사 조절부위가 있었다. Luciferase reporter 시스템을 이용한 5'쪽 근접 부분의 deletion 실험을 통하여 -1.1 kb 부분이 프로모터 활성을 갖고 있음을 확인하였다. Primer extension 실험을 통하여 전사가 첫 번째 ATG 번역 시작 코돈으로부터 -72 bp 윗쪽으로부터 주로 시작됨을 알 수 있었다. 이 연구에서 우리는 새로운 지질대사에 관여하는 AC homologue 유전자를 클론하였다. 이 새로운 단백질, hACH의 연구는 지질 대사과정을 이해하고 나아가 지질을 매개로 하는 세포 내 신호전달 과정을 이해하는데 도움을 줄 것으로 여겨진다.
