The thermal stability and catalytic activity of phospholipase $A_1$ from Serratia sp. MK1 were improved by an evolutionary molecular engineering. Two thermostable mutants were isolated after sequential rounds of error-prone PCR to introduce random mutations and filter-based screening of the resultant mutant library, and identified as having six (mutant TA3) and seven (mutant TA13) amino acid substitutions, respectively. Different types of the substitutions were found in two mutants, resulting in the increase of nonploar residues (mutant TA3) or changes between side chains within polar or charged residues (mutant TA13). The wild-type and mutant enzymes were purified, and the effect of temperature on their stability and catalytic activity was investigated. The $T_m$ values of TA3 and TA13 were increased by 7 and 11℃, respectively. Compared to the wild-type enzyme, the temperature optimum for activity was about 10℃ higher and the specific activity was significantly higher at the temperature range examined. The stability and activity of phospholipase $A_1$ were also enhanced by the same approach that used for thermostability evolution, except that the positive nine variants from the first round (30% DMSO, 6 h) were in vitro recombined by DNA shuffling in preparing the second library. Three mutants (SA8, SA17 and SA20) were isolated after exposure to 50% DMSO for 36 h and activity assay on the screening gel containing 30% DMSO. Mutants SA8, SA17 and SA20 were 3.0, 3.9, 2.6-fold more stable in 50% DMSO and 4.6, 5.5, 4.0-fold more active in 30% DMSO than the wild-type phospholipase $A_1$. Three mutants were also more stable in all organic solvents tested, compared with the wild-type enzyme. Thus, evolutionary molecular engineering was found to be an effective and efficient approach to increasing stability without compromising enzyme activity. Moreover, the more stable and more active enzymes could be obtained when the pressures on two properties (i.e. stability and activity) were simultaneously applied.
인위적 분자 진화 방법을 이용하여 phospholipase $A_1$의 고온에서의 안정성과 효소활성을 증가시켰다. 임의의 돌연변이를 유발하기 위한 error-prone PCR과 그로부터의 돌연변이 집합에 대한 filter-based screening을 연속적으로 반복한 후, 2개의 열안정성 phospholipase $A_1$ (TA3, TA13) 을 분리하였다. 이들은 각각 6개와 7개의 아미노산 치환을 가지고 있음이 밝혀졌는데, 서로 다른 방식의 치환이 일어났음을 알 수 있다. TA3의 경우에는 비극성 잔기의 증가로 인한 내부의 소수성 증가가 열안정성의 주요 요인이었으며, TA13에서는 극성 또는 전하를 가진 잔기들 사이의 치환이 주로 발견되어는데, 이는 수소결합력의 증가에 의한 열안정성의 획득으로 여겨진다. Phospholipase $A_1$과 그에 대한 열안정성 변이효소 (TA3, TA13)를 정제하여 그들의 안정성과 효소활성에 미치는 온도의 영향을 살펴본 결과, 각각 7℃와 11℃ 만큼 $T_m$값이 증가하였으며, 효소활성에 대한 최적온도가 10℃ 증가하였고, 고온에서의 효소활성이 전 범위에서 매우 높아졌음이 밝혀졌다. 또한 유기용매 환경에서의 효소 사용시 문제점인 효소의 안정성과 효소활성을 향상하기 위하여 앞서 사용한 error-prone PCR과 DNA-shuffling을 통한 임의의 다양한 돌연변이체를 확보하고 유전자를 조합한 후, 30% DMSO 조건과 50% DMSO 조건에서 연속하여 탐색하였다. 첫번째 단계에서 분리한 9개의 유기용매 내성 phospholipase A1 변이체를 유전자 조합한후, 최종적으로 3개의 우수한 변이체 (SA8, SA17, SA20) 를 확보하였다. 각 변이체는 50% DMSO 환경에서 3, 3.9, 2.6배 더 높은 효소 안정성을 나타내었고, 30% DMSO환경에서 4.6, 5.5, 4배 더 높은 활성을 가지고 있었다. 또한 모델 용매인 DMSO에서 인위적 분자 진화 과정을 통해 얻어진 모든 우수변이체는 다른 유기용매 조건에서도 안정성이 향상되었음이 밝혀졌다. 이와 같이 진화적 방법의 효소 개량은 효소활성을 떨어뜨림 없이 효소의 안정성을 높일 수 있는 방법이었으며, 본 연구에서 고안한 filter-based screening방법은 효소 안정성과 효소 활성과 같은 둘 이상의 특성을 탐색할 수 있는 방법이었음을 알 수 있다.