In order to investigate the physiological roles of acetate metabolism, the pta mutants of Escherichia coli defective in phosphotransacetylase, the first enzyme of the acetate pathway, was characterized. A pta mutant of E. coli W3100 excreted unusual by-products such as pyruvate,D-lactate and L-glutamate instead of acetate when grew on glucose minimal medium. The pta mutant was found to grow slowly on glucose, tryptone broth (TB), or pyruvate but it grew normally on glycerol or succinate. The defective growth and starvation survival of the pta mutant were restored by the introduction of poly-β-hydroxybutyrate (PHB) synthesis genes (phbCAB) from Alcaligenes eutrophus, indicating that the growth defect of the pta mutant was due to a perturbation of acetyl-CoA flux. By the stoichiometric analysis of the metabolic fluxes of the central metabolism, it was found that the amount of pyruvate generated from glucose transport by the PEP-dependent phosphotransferase system (PTS) exceeded the required amount of precursor metabolites downstream of pyruvate for biomass synthesis.
The perturbed acetyl-CoA flux in the pta mutant effected redirection of overall fermentation metabolism. A pta mutant of E. coli RR1 strain was found to metabolize glucose to D-lactate with a small amount of succinate by-product under anaerobic conditions. A further mutation in ppc made the mutant produce D-lactate like a homofermentative lactic acid bacterium. When this pta ppc double mutant was grown to higher biomass concentration under aerobic conditions, before shifting to the anaerobic phase of D-lactate production, more than 62.2 g/l of D-lactate was produced in 60 hours, reaching a volumetric productivity of 1.04g/L/hr. When L-lactate dehydrogenase gene from Lactobacillus casei was introduced into a pta ldhA strain, which lacked Pta and D-lactate dehydrogenase, the recombinant strain was able to metabolize glucose to L-lactate as the major fermentation product, and up to 45g/L of L-lactate was produced in 67 hours. The blocked acetate and lactate metabolism also affected on $C_3-C_4$ flux. In anaerobic conditions, the pta ldhA mutant produced increased amount of pyruvate and succinate from glucose. When $NaHCO_3$ was added as the source of carbon dioxide, the succinate became the major fermentation product, representing 38 % total carbon in fermentative products from consumed glucose. These results suggest that E. coli excretes acetate due to the pyruvate flux from PTS and that any method, which alleviates the over-supply of acetyl-CoA would restore normal growth to the pta mutant. The blocked acetate metabolism may be used as the potential driving force for useful products such as D- or L-lactate, or $C_4$-dicarboxylic acid.
대장균 초산대사의 생리적 기능을 규명하기 위하여 초산대사의 phosphotransacetylase의 활성이 유전적으로 제거된 pta 돌연변이주의 특성을 연구하였다. 대장균 W3110균주의 pta 돌연변이주는 glucose 최소배지에서 성장할 때 pyruvate, D-lactate, glutamate와 같은 부대사산물을 생산하였다. 이 돌연변이주는 glucose, tryptone broth, 그리고 pyruvate에서는 성장속도가 낮아지나 glycerol 이나 succinate에서는 정상적으로 성장하는 것이 관찰되었다. pta 돌연변이주에 Alcaligenes eutrophus 유래의 PHB 생합성 유전자를 도입하면 성장속도 및 starvation 상태에서의 생존능에서 발견되는 결함이 회복됨을 볼 수 있었는데, 이는 pta 돌연변이주의 성장 결함이 acetyl-CoA flux의 혼란에서 기인하는 것임을 보여준다. 대장균 중심대사경로에서의 대사흐름분석을 통하여 phosphoenolpyruvate에서 인산기를 glucose에 전달하면서 PTS(phosphotransferase system)를 통하여 glucose를 세포 내로 수송하는 과정에서 세포생산을 위해서 필요한 량 보다 더 많은 pyruvate가 생성되는 것을 알 수 있었다.
pta 돌연변이주의 불균형화된 acetyl-CoA flux는 전체 발효대사에도 변화를 가져왔다. 대장균 RR1 균주의 pta 돌연변이주의 경우 혐기조건에서 glucose 로부터 주로 D-lactate를 생산함을 알 수 있었다. 이 돌연변이주에서 약간 생성되는 succinate의 생산을 억제하기 위하여 ppc 유전자에 돌연변이를 도입한 결과, 만들어진 대장균 RR1 pta ppc 돌연변이주는 마치 젖산발효를 수행하는 젖산균과 같이 D-lactate 만을 생산하였다. 이 균주를 호기조건에서 배양 후 혐기조건을 가하는 방법으로 60시간만에 62 g/L의 D-lactate를 생산할 수 있었다. 한편 acetate 및 D-lactate 생산경로가 결손된 RR1 pta ldhA 돌연변이주는 Lactobacillus casei 유래의 L-lactate dehydrogenase를 도입하였을 때 L-lactate를 주 발효산물로 생성하여 67시간 만에 45g/L의 L-lactate를 축적하였다. 불균형화 된 acetate 및 D-lactate flux는 C3-C4 연결경로로의 carbon flux에도 영향을 주어서 pta ldhA 돌연변이주는 혐기조건에서 pyruvate와 succinate 생산이 증가되었다. 배지 내 $CO_2$ 농도를 높여주었을 경우 succinate가 주요 발효산물로 생산되었다. 이러한 결과는 대장균의 초산 대사가 PTS 에 의한 pyruvate 및 acetyl-CoA의 과잉공급 때문이고 acetyl-CoA flux를 해결해 줄 수 있는 대사경로를 도입하면 pta 돌연변이주의 정상성장을 회복시킬 수 있음을 제안할 수 있었다. 또한 pta 돌연변이주의 acetyl-CoA flux는 D-lactate, L-lactate 혹은 C4-dicarboxylic acid 와 같은 유용대사산물의 생산을 위한 driving force로 사용될 수 있는 potential을 가지고 있음을 알 수 있었다.
