Staphylokinase (SAK), a nonglycosylated single-chain protein secreted by certain strain of Staphylococcus aureus, functions as profibrinolytic agent by virtue of its ability to convert human plasminogen (hPg) to its active serine protease form, plasmin (hPm). Secretion of SAK was designed in Pichia pastoris that is methylotrophic yeast, capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The Pichia expression vector, pPIC9K has AOX1 promoter and a pre-pro peptide signal sequence of mating factor. AOX1 promoter was tightly regulated and highly induced by methanol. The SAK gene was introduced into pPIC9K vector. The resulting expression vector, pPIC-SAK, was transformed into the P. pastoris GS115 by electroporation. Secretion of recombinant SAK was confirmed by skim-milk human plasminogen overlay test. Mixture of glycosylated and nonglycosylated SAK was secreted into the culture medium at the level of about 300mg/liter. Glycosylated SAK occupies about 80% in the total SAK secretion amount. Both of glycosylated and nonglycosylated SAKs were separated through CM-chromatography and ConA affinity chromatography. Nonglycosylated SAK shows plasminogen activation activity, while glycosylated SAK did not have the activity. However, removal of glycans in glycosylated SAK recovered the SAK activity. As result, inactive glycosylated recombinant SAK that consists of major part in secreted SAK was easily purified by ConA affinity chromatography and subsequently converted to biologically active SAK by N-glycosidase treatment.
스타필로키나제는 몇몇 종류의 스타필로코쿠스 아우레우스균으로부터 분비되는 올리고당이 결합하지 않은 단백질로써, 사람의 플라스미노젠을 활성화된 세린 프로테아제 형태인 플라스민으로 바꾸는 기능때문에 혈전용해제로 쓰이고 있다. 메탄올을 유일한 탄소원으로 사용해서도 대사를 수행할 수 있는 호메탄올 효모인 피키아 패스토리스에서 스타필로키나제의 분비를 고안하였다. 피키아 발현 벡터인 pPIC9K는 AOX1 유전자의 전사촉진제와 알파 교배 인자의 pre-pro 펩타이드 신호서열을 가지고 있다. AOX1유전자의 전사촉진제는 메탄올에 의해서 정확하게 조절이 되고 강하게 전사를 유도한다. 스타필로키나제의 유전자를 pPIC9K벡터에 도입하였다. 완성된 발현 벡터는 pPIC-SAK로 명명이 되었고, 피키아 패스토리스 GS115균주에 전기충격법에 의해서 형질전환되었다. 재조합 스타필로키나제의 분비는 스킴밀크 사람 플라스미노젠 덧씌우기 실험으로 확인하였다. 올리고당이 결합한 스타필로키나제와 결합하지 않은 것의 혼합물이 약 300mg/liter정도 배지로 분비되었다. 올리고당이 결합한 스타필로키나제가 전체 발현되는 스타필로키나제양의 약80%를 차지하였다. 올리고당이 결합한 스타필로키나제와 결합하지 않은 것은 양이온 교환 크로마토그래피법과 ConA 친화성 크로마토그래피법을 이용하여 분리되었다. 올리고당이 결합하지 않은 스타필로키나제는 플라스미노젠 활성화 기능을 보여주었지만 올리고당이 결합한 스타필로키나제는 그 기능을 잃어버렸다. 그러나 올리고당이 결합한 스타필로키나제의 올리고당을 제거하자 그 기능이 회복되었다. 결론적으로 효모에서 발현되는 스타필로키나제의 대부분을 차지하는 활성이 없는 올리고당이 결합한 재조합 스타필로키나제는 ConA 친화성 크로마토그래피법에 의해서 쉽게 정제되고 올리고당 제거 효소에 의해서 생물학적으로 활성화된다.
