Polyhydroxyalkanoates (PHAs) including poly(3-hydroxybutyrate) [P(3HB)], the most well known member of PHAs, can be produced from renewable source and are biodegradable with similar material properties and processibility to conventional plastic material. From the studies on the design and economic evaluation of the processes for the production of PHAs, it was found that the PHA productivity, PHA content and recovery method are the most important factors determining the overall production cost.
Recombinant Escherichia coli harboring the heterologous PHA biosynthesis genes has several advantages over other wild-type PHA producers including Ralstonia eutropha and Alcaligenes latus. But, the highest P(3HB) productivity obtained by the fed-batch culture of recombinant E. coli was lower than that achieved by of A. latus. It was reasoned that the efficient synthesis of P(3HB) in A. latus is due to the greater catalytic power of the PHA biosynthetic enzymes in this bacterium. Therefore, economical production of P(3HB) by recombinant E. coli was thought to be possible if P(3HB) productivity can be increased by cloning the A. latus PHA biosynthesis genes. A 6.4-kb A. latus genomic DNA (AL64) coding for the PHA biosynthetic enzymes were cloned in E. coli by screening the transformants that appeared as opaque colonies in LB medium containing glucose. The nucleotide sequence analysis of the cloned AL64 fragment indicated that $phaC_Al, phaA_Al and phaB_Al$ genes, coding PHA synthase, ketothiolase and reductase, respectively, were clustered in a single operon (phaCAB) as in R. eutropha. Several stable recombinant plasmids containing the A. latus PHA biosynthesis genes were constructed. P(3HB) production rate was higher for recombinant E. coli strains harboring the A. latus PHA biosynthesis genes compared with recombinant E. coli strains harboring the R. eutropha PHA biosynthesis genes. Fed-batch cultures of XL1-Blue(pJC3) and XL1-Blue(pJC4), recombinant E. coli strains harboring the A. latus PHA biosynthesis genes, resulted in high concentrations of cell and P(3HB) (greater than 140 g P(3HB)/L) with high productivity. Especially, P(3HB) concentration and P(3HB) productivity obtained with XL1-Blue(pJC4) were as high as 141.6 g/L and 4.63 g P(3HB)/L-h, respectively.
The recombinant E. coli XL1-Blue(pJC4) harboring A. latus PHA biosynthesis genes and the fed-batch culture strategies were applied for the production of P(3HB-co-3HV) copolymer. In the fed-batch culture of recombinant E. coli XL1-Blue(pJC4) with the feeding strategy that increased glucose and propionic acid concentrations to 20 g/L and 20 mM, respectively, after each feeding, cell concentration obtained was 120.3 g/L, but the PHA content was rather low (42.5 wt%). It was found that propionic acid accumulated during the fed-batch culture. To stimulate the uptake of propionic acid, acetic acid induction experiments was carried out. The concentrations of cell and PHA, PHA content and PHA productivity were all increased by acetic acid induction. In the fed-batch culture with oleic acid supplementation, the 3HV fraction was considerably increased. To decrease the accumulation of propionic acid in the medium, we carried out fed-batch cultures with different feeding solutions containing lower concentrations of propionic acid. When the feeding solution was added to increase propionic acid concentration to 5 mM with oleic acid supplementation after the acetic acid induction, the concentration of PHA, PHA content and 3HV fraction were 158.8 g/L, 78.2 wt% and 10.6 mol%, respectively, with the productivity of 2.88 g PHA/L-h. In a large scale fermentor (30 L) with poor oxygen transfer, the concentration of PHA and PHA content obtained were 29.6 g/L and 70.1 wt%, respectively, resulting in productivity of 1.36 g PHA/L-h.
Since recombinant E. coli accumulating a large amount of P(3HB) becomes fragile, it was reasoned that an efficient and economical recovery might be possible by digestion of non PHA cellular materials with inexpensive chemicals. Among various chemicals tested, NaOH and KOH were efficient and economical for the recovery of P(3HB). The effect of cell concentration, alkali concentration, digestion temperature and digestion time length on the purity and yield of recovered P(3HB) were examined. P(3HB) with purity of greater than 98.5% could be obtained at an optimal condition. Also, this alkali digestion method caused little degradation of P(3HB) during recovery process. The NaOH digestion method also has an economical advantage over other recovery methods. In economic evaluation of the processes for PHA production with different recovery methods, the production cost of P(3HB) by employing the NaOH digestion method was considerably lower than that obtained using the recovery method of surfactant-hypochlorite digestion method.
During the recovery of P(3HB), the removal of endotoxin was considered. Endotoxin levels present in P(3HB) recovered by chloroform extraction were less than 10 endotoxin unit (EU)/g P(3HB) irrespective of bacterial strains and P(3HB) content. Endotoxin level of P(3HB) was less than 1 Endotoxin Unit/g P(3HB) by NaOH digestion for P(3HB) recovery from recombinant E. coli.
These results provided that PHAs including P(3HB) and P(3HB-co-3HV) could be economically produced by recombinant E. coli, and recombinant E. coli is a good candidate for the production of PHA.
미생물에 의하여 생산되며 분해되는 polyhydroxyalkanoates (PHAs)는 상용 고분자와 유사한 기계적 물성을 갖고 있는 polyester 구조의 고분자 물질이다. 미생물 발효에 의한 PHA 생산공정의 경제성 평가로부터, PHA생산성, PHA 함량, 그리고 정제방법 등이 PHA 생산단가를 결정하는 가장 중요한 원인으로 밝혀졌다.
재조합 대장균은 Alcaligenes latus와 Ralstonia eutropha를 포함한 다른 여러 PHA 생산 균주에 비해 여러 가지 장점들을 가지고 있다. 하지만 지금까지 개발된 재조합 대장균에 의한 poly(3-hydroxybutyrate) [P(3HB)], 대표적인 PHA, 생산에서 얻어진 생산성은 A. latus에서 얻어진 생산성보다 낮은 값을 가지고 있다. 따라서 A. latus의 효과적인 PHA 생합성 유전자를 갖는 재조합 대장균을 개발하여 PHA를 경제적으로 생산하려는 연구를 수행하였다. A. latus의 전체 염색체의 단편들로 형질 전환된 재조합 대장균 가운데서, P(3HB)를 축적하는 재조합 대장균을 선별하여 확인한 결과, 6.4-kb 크기의 A. latus의 염색체 부분 (AL64)을 발견하였다. AL64의 염색체 서열을 확인한 결과 PHA 생합성에 관여하는 PHA synthase, ketothiolase, reductase를 coding하는 $phaC_Al, phaA_Al, phaB_Al$이 하나의 operon내에 phaCAB 순서로 존재한다는 것을 밝혔다. 이를 이용하여A. latus PHA 생 합성 유전자를 갖는 여러 안정한 재조합 plasmid를 제작하였다. 이렇게 제작된 plasmid로 형질 전환 된 재조합 대장균을 이전까지 연구되어졌던 R. eutropha PHA 생합성 유전자를 갖는 재조합 대장균과 세포 성장과 P(3HB) 합성능에 대하여 비교한 결과, A. latus PHA 생합성 유전자를 가지고 있는 재조합 대장균 XL1-Blue(pJC3)와 XL1-Blue(pJC4)는 R. eutropha PHA 생합성 유전자를 갖는 재조합 대장균 보다 우수한 세포 성장과 P(3HB) 합성능을 나타내었다. 특히 XL1-Blue(pJC4)의 유가식 배양 결과, 최종 P(3HB) 농도 141.6 g/L와 P(3HB) 생산성 4.63 g P(3HB)/L-h의 값을 가졌다.
재조합 대장균 XL1-Blue(pJC4)을 이용한 포도당과 propionic acid로부터의 poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) [P(3HB-co-3HV)]의 생산을 연구하였다. 배지내의 포도당과 propionic acid의 농도가 20 g/L와 20 mM이 되도록 공급액이 첨가되는 유가식 배양에서 XL1-Blue(pJC4)는 최종 세포 농도 120.3 g/L까지 증가하였으나, PHA 함량은 42.5 wt%에 그쳤다. 이러한 낮은 PHA함량은 배지내의 잔여 propionic acid 농도가 높기 때문이었다. 대장균에서의 propionic acid의 이용성을 높이기 위하여 acetic acid induction 후에 유가식 배양을 수행한 결과, 세포농도, PHA 농도, PHA 함량, PHA 생산성은 모두 증가하였다. 유가식 배양 도중에 oleic acid를 첨가할 경우 3HV 분율이 크게 증가하였다. 하지만 여전히 높은 잔여 propionic acid의 농도와 낮은 PHA 함량 문제를 해결하기 위하여, 낮은 propionic acid의 농도를 갖는 공급액을 이용한 유가식 배양을 수행하였다. 배지 내의 propionic acid의 농도가 5 mM이 되도록 공급액이 첨가되는 유가식 배양에서 acetic acid induction 후 oleic acid가 첨가될 경우, XL1-Blue(pJC4)는 158.8 g/L의 PHA 농도, 78.2 wt%의 PHA함량, 10.6 mol% 3HV 분율을 가졌으며, 이 때 생산성은 2.88 g PHA/L-h였다. 큰 규모의 발효기(30 L)에서의 유가식 배양을 수행한 결과 30 g/L의 PHA농도, 70 wt%의 PHA함량을 1.36 g PHA/L-h의 생산성으로 얻었다.
높은 함량으로 PHA를 축적하고 있는 재조합 대장균은 세포의 파괴가 용이하다는 장점을 이용하여, PHA 생산 단가의 절감을 위한 단순소화 방법에 의한 경제적이고 효율적인 PHA 정제방법을 개발하였다. 사용된 여러 화합물들 중에서 NaOH와 KOH가 효과적이고 경제적으로 P(3HB)를 정제하였다. 세포 농도, 염기의 농도, 소화 온도 및 시간 등에 의한 P(3HB)의 정제 순도와 정제 효율을 비교하여, 최적의 조건에서 98.5% 이상의 순도를 갖는 P(3HB)를 회수하였다. 또한 단순소화 방법에 의해 정제된 P(3HB)의 분자량을 측정한 결과, 분자량 변화가 거의 나타나지 않았기 때문에, 정제 과정 중의 P(3HB)분해가 일어나지 않는다는 것을 알 수 있었다. 단순소화 방법에 의한 정제 과정을 갖는 P(3HB) 생산 공정의 경제성 평가로부터, 개발된 단순 소화 공정이 P(3HB) 생산 단가를 현저히 낮출 수 있다는 것이 밝혀졌다.
또한 정제 후 얻어진 P(3HB) 시료에서의 endotoxin의 양을 측정하였다. 용매추출 방법과 개발된 NaOH 소화 방법에 의하여 정제된 P(3HB)의 endotoxin 양을 측정한 결과 낮은 endotoxin양 (10 endotoxin unit/g P(3HB) 이하)이 검출되었으며, 특히 NaOH 소화 방법의 경우 1 endotoxin unit/g P(3HB) 이하의 값을 가졌다.
이러한 결과들은 재조합 대장균으로부터 생분해성 고분자 PHA가 경제적인 방법으로 생산될 수 있다는 것을 보여주며, 따라서 PHA 생산 균주로서의 재조합 대장균의 가능성을 제시하여 주고 있다.
