Ribose-binding protein (RBP), one of the periplasmic binding proteins in E. coli, is involved in the active transport of ribose and chemotaxis. RBP is exported to the periplasm with the help of the secretion apparatus including SecA and SecYEG. Although it was reported that RBP is translocated in a Ffh dependent manner in vivo, there are still some controversies as to what factors are involved in the targeting of RBP, especially about the involvement of SecB. To elucidate the exact targeting mechanism of RBP to the membrane, studies with an in vitro translocation system are required.
In the present investigation, the translocation of RBP was studied using the in vitro translation/translocation system. It was found that RBP is translocated into heterologous eukaryotic microsomes co-translationally as well as post-translationally. However, RBP is translocated into E. coli inverted membrane vesicles(IMV) only post-translationally. During the translocation across the IMV membrane, degradated forms of RBP with the molar mass of 14 and 16 KDa were produced. Various factors such as phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF), GTP and proton motive force affected the translocation of RBP. The increase of RBP translocation induced by GTP suggests that the Ffh, which have GTPase activity, is involved in the targeting. In the presence of PMSF, no degradated products were observed but instead the mature form of RBP appeared. Moreover, the efficiency of RBP translocation was increased by PMSF. An unknown protease might be involved in the in vitro translocation of RBP. It was also found that SecB enhanced the post-translational translocation of RBP. It appears that RBP is targeted via both Ffh and SecB. It was also found that the RBP translocation is inhibited by an unknown protease.
리보스 결합단백질은 대장균 periplasm에 존재하는 기질 결합 단백질중의 하나로 리보스에 대한 능동수송과 주화성에 관계한다. 리보스 결합 단백질은 SecA, SecYEG로 이루어진 막전위 기구에 의해서 periplasm 으로 이동한다. 리보스 결합 단백질의 막전위시 Ffh에 의존적이라는 in vivo 결과가 있긴 하지만 SecB 관련성을 포함해서 어떤 인자들이 관여하는지에 관해서 논란이 있다. 따라서, 리보스 결합 단백질의 정확한 막전위 기작을 알기 위해서는 in vitro 실험계의 구축이 필요하다. 이번 연구에서는 in vitro translation/translocation 계를 구축하여 리보스 결합 단백질의 막전위에 어떤 인자가 작용하는지를 분석하고자 했다.
진핵의 microsomes을 통해서는 co- and post-translational 막전위가 일어나는 반면 원핵의 역상막을 통해서는 단지 post-translational 막전위만 일어났다. 역상막을 통한 막전위시에는 리보스 결합 단백질의 분해형인 14 kDa와 16 kDa의 단편이 생성되었다. PMSF, GTP, proton motive force 같은 여러 인자들이 리보스 결합 단백질의 막전위에 영향을 주었다. GTP에 의한 영향은 GTPase 활성을 가지고 있는 Ffh에 의해서 일어났을 것이다. PMSF를 처리한 경우에 14 kDa와 16 kDa의 단편이 사라지고 막전위 효율이 증가되는것으로 보아 아직 알지 못하는 단백질 분해 효소가 리보스 결합 단백질의 막전위에 관여하는것 같다. SecB 또한 리보스 결합 단백질의 막전위 효율을 증가시켰다. 리보스 결합 단백질은 어느 한가지 경로만을 거치는 것이 아니라 Ffh, SecB 혹은 단백질 분해 효소가 영향을 미치는 다양한 경로들에 의해서 막전위가 일어남을 알 수 있었다.