Pseudomonas putida 3SK, a solvent resistant strain, produced extracellular lipase. We observed that there was another lipolytic enzyme, which had no lipase activity in P. putida 3SK. This lipolytic enzyme, an esterase, was cloned in Escherichia coli and sequenced. The cloned esterase gene, which designated estA, had single open reading frame of 1941 nucleotides. The estA gene encoded a protein of 646 amino acids and was predicted to belong to the GDSL family of lipolytic enzymes. The consensus motif GxSxxDxG, which was a characteristic feature of the GDSL lipolytic enzymes, was found in estA. A putative catalytic triad, $Ser^{38}$, $Asp^{172}$, and $His^{313}$ was also determined. The calculated molecular weight was 69.6kDa and theoretical isoelectric point (pI) was 4.68. The esterase expressed in E. coli was purified by Ni-NTA affinity chromatography and FPLC gel filtration chromatography. The molecular weight of the purified esterase was about 65kDa and judging from the immunoblot analysis, an esterase from P. putida 3SK was extracellular enzyme. The optimum pH and temperature were pH 11 and 50℃, respectively. In the study of effect of organic solvents, DMF was the most effective solvent among the solvents tested for the p-nitrophenyl myristate hydrolysis. On the basis of substrate specificity and sensitivity toward various inhibitors, P. putida 3SK esterase appears to be an acetylesterase (E.C. 3.1.1.6).
내 유기 용매성 균주로 알려진 Pseudomonas putida 3SK로부터 esterase 유전자 (estA)를 E.coli XL1-blue에서 cloning 하였다. Esterase 유전자 염기 서열을 분석한 결과 1941 개의 염기쌍으로 이루어진 하나의 open reading frame으로 구성되어 있었으며 estA 유전자는 646 개의 아미노산을 coding 함을 알 수 있었다. 유전자 database의 검색 결과 이 esterase는 새로운 lipolytic enzyme 그룹인 GDSL family에 속함을 알 수 있었고 계산상의 분자량은 69.6kDa, 이론상 등전점(theoretical isoelectric point)은 4.68이었다. EstA는 24개의 N-terminal signal sequence를 가지는 것을 추정되며 G+C content는 67.5%였다.
GDSL lipolytic enzymes의 특징인 GxSxxDxG consensus motif가 estA에서 발견되었으며 5개의 consensus sequence blocks로부터 잠정적인 catalytic triad ($Ser^{38}$, $Asp^{172}$, $His^{313}$)를 결정할 수 있었다.
EstA 유전자를 E.coli JM109에서 pkk223-3의 tac promoter 조절하에서 발현 시켰을 때 대부분의 esterase는 inclusion body 로 형성되었고 소량 soluble from으로 존재하는 protein을 정제하여 그 특성 파악에 사용하였으며, 정제된 esterase의 분자량은 대략 65kDa이었다, 정제된 esterase를 antigen으로 이용하여 esterase antibody를 제조하였고, immunoblot 분석을 통하여 P. putida 3SK esterase가 extracellular enzyme 임을 알 수 있었다. p-nitrophenyl myristate의 가수분해 반응에서 최적 pH는 11, 최적 온도 50℃ 였으며 여러 가지 유기 용매를 첨가한 효소 반응에서 DMF가 효소 활성에 가장 효과적이었고, 효소의 안정성 측면서는 dioxane이 가장 효과적이었다. 이 효소의 활성은 수은 이온과 아연 이온에 의해 강한 저해를 받으며 PMSF 나 EDTA에 대해서는 저해 받지 않았다.
여러 가지 ester 화합물에 대한 특이성과 다양한 저해제에 대한 민감도에 근거하여 P.putida 3SK esterase는 acetylesterase(E.C.3.1.1.6)인 것으로 추정되어진다.