The Hepatitis C virus (HCV) is the major etiologic agent of transfusion non-A, non-B hepatitis. The NS3 protein has the typical amino acid motifs of the DEAD box family, the RNA helicase superfamily among the nonstructural proteins of HCV. The characterization of the detailed biochmical properties of the HCV NS3 protein, which seems to be a component of the replication complex, was necessary for understanding of the mechanism of HCV replication. The RNA helicase activity of the HCV NS3 protein was previously determined. To compare the biochemical properties of the HCV NS3 protein with the other helicases, and to assign the in vivo function of this helicase in the cellular and viral life cycle from the comparative data, the detailed characterization of the RNA binding and helicase activities was performed. The preference for the poly(U) and poly(A) in the RNA binding reaction implies that the HCV NS3 protein could easily bind to the 3''tail of the HCV RNA genome and begin the replication of the viral genome from the tail. The HCV RNA helicase unwinds RNA/DNA heteroduplexes as well as RNA/RNA duplexes in the aspects of the substrate specificity, and it catalytically translocates in the 3'' to 5'' direction. The HCV NS3 protein could unwind the DNA duplex as well. This DNA helicase activity implies that the HCV NS3 protein may be involved in the transcription, repair, and replication of the infected cell, as well as the viral gemone replication, like the other multifunctional RNA and DNA helicases. To assign the mechanism of this helicase, the detailed biochemical analysis on the DNA helicase activity was performed. Th e high affinity for the ATP analogs and the low affinity for ADP imply the mechanism of the helicase reaction; when ATP bound to the HCV NS3 protein is hydrolyzed, ADP can be quickly dissociated. The results in the competitive experiments suggest that the NS3 protein does not have dsRNA and ssDNA binding region. The high processivity (up to 500 bp) suggest that the helicase could be involved in the replication and the repair processes as well as the transcription The results suggest that the HCV NS3 protein recognize the single-stranded region of the substrates and exchage ADP with ATP with different affinity for them.
To determine the roles of the amino acids of the HCV NS3 protein in ATPase, RNA binding, and helicase activities, total twenty seven point-mutated proteins of the hepatitis C virus C-terminal helicase were made. The high ATPase activity of CH1317AD and H1318D proteins in the absence of cofactors, means that this region is involved in the interaction with the TATPP region, so the mutation in this region may mimic the state of the RNA cofactor binding. The TATPP region was important for the RNA-stimulated ATPase and helicase activity as a flexible hinge or a switch region to transfer the conformational change induced by the RNA binding to the ATP hydrolysis domain. The results suggest that the Walker A, B motif, and the TATPP region have the important roles in the RNA-stimulated ATPase and helicase activities and that the DECH region interact with the TATPP region. The results are well matched with the structural data which shows the importance of the Walker A, B, and the TATPP region for ATPase and helicase activities.
In another series of experiment, the helicase activity of another flaviviridae hepatitis virus, the Hepatitis G virus (HGV) NS3 protein were determined. The HGV NS3 protein contains amino acid sequence motifs typical of ATPase and RNA helicase proteins as well. To compare the biochemical properties of the HGV NS3 protein with the HCV NS3 protein and the other helicases, the detailed biochemical characterization was performed. The amylose resin-purified MBP-HGV/NS3 protein possessed RNA-stimulated ATPase and RNA helicase activities as expected from the amino acid sequences comparison. Characterization of the ATPase and RNA helicase activities of MBP-HGV/NS3 showed that the optimal reaction conditions were similar to those of other Flaviviridae viral NS3 proteins. The results in a gel retardation assay imply that the HGV NS3 protein has no duplex binding region. It is also found that the conserved motifs VI was important for RNA binding. Further deletion mapping showed that the RNA binding domain was located between residues 1383 and 1395, QRRGRTGRGRSGR. The MBP-HCV/NS3 protein also contains the RNA binding domain in the similar domain. These results suggest that the HCV and HGV NS3 protein unwind the duplex with the quite similar mechanism. These helicases might act as the multifunctional proteins involved in the cellular regulation like the SV40 large T antigen.
C형 간염 바이러스 (HCV)는 비 A형, B형 간염의 주 병원체이다. HCV의 비구조 단백질 중, NS3 단백질은 DEAD box RNA helicase family의 전형적인 amino acid 서열을 가지고 있었다. 다른 바이러스들의 경우와 마찬가지로 NS3 단백질은 복제 기작에 관여할 것으로 생각되어지고, 따라서 NS3 단백질의 생화학적인 성질을 조사하는 것은 HCV 바이러스의 복제기작을 이해하는데 중요한 단계이다. 이전에 NS3의 생화학적 성질을 다른 나선효소들과 비교하고, 세포 내에서의 역할을 유추하기 위해, RNA binding activity 와 RNA helicase activity 의 세부적인 생화학적 성질을 조사하였다. NS3 단백질은 특정 시퀀스에 결합하지는 않는 것으로 보이며, homoribopolymer에의 결합 정도를 조사해 봤을 땐 그 결합 순서는 poly(U) >> poly(G), poly(C) 순이다. 이 poly(U)와 poly(A)에 강한 기질 특이성은 NS3 단백질이 바이러스의 3'' tail에 붙어서 복제기작을 이 곳에서 시작할 가능성을 제시한다. 기질 특이성의 측면으로서는, C형 간염 바이러스 NS3 단백질은 RNA/DNA heteroduplexes와 RNA/RNA duplexes 및 DNA/DNA duplex를 풀 수 있었고 그 방향성은 3'' to 5''으로 결정되었다. 이러한 DNA 나선효소 활성은 다른 다기능 단백질의 경우들과 마찬가지로, NS3 단백질이 세포내 전사 및 복제에 관여할 가능성을 제시한다. 다른 DNA helicase 들과의 생화학적인 성질을 비교하기 위해 C형 간염 바이러스 NS3 단백질의 DNA helicase 활성을 자세히 분석하였다. 모든 NTPs와 rNTPs는 그 DNA helicase 활성의 에너지원으로 사용될 수 있으나, GTP와 dGTP는 가장 약한 경향을 보였으며, DNA helicase 활성에 대해서 $ATP_γ$ > AMPPNA 와 AMPPCP > ADP 의 순으로 저해 활성을 보였다. 이 효소의 processivity를 결정하는 실험에서는, C형 간염 바이러스 NS3 단백질은 500 bp 크기의 DNA duplex를 해리할 수 있어서 전사이외에도 DNA 의 복제 및 복구에도 관여할 가능성을 보여준다. 이러한 데이터들이 제시하는 것은 HCV NS3 단백질이 바이러스의 복제 뿐 아니라 세포 내의 전사, 복제 등의 조절에 관여할 수도 있다는 사실이다.
Helicase 활성에 중요한 amino acid를 찾기 위하여 모두 27개의 mutagenesis 를 수행하였을 때, 그 결과로 C형 간염 바이러스 NS3 단백질의 Walker A motif 는 GKS motif 로 축소 시킬 수 있었다. TATPP 부위도 RNA-stimulated ATPase와 helicase 활성에 중요하고 그 구조에서 예상했던 바 대로 switch region으로서의 역할을 하는 것이 판명되었다. 이러한 데이터들이 제시하는 바는 Walker A, B motif 및 TATPP 부위가 실제로 나선효소의 활성에 관여한다는 것이고, 여태까지 제시되었던, structural data 들과 잘 일치하는 것을 보여준다.
G형 간염 바이러스는 C형 간여 바이러스와 마찬가지로 flaviviridae에 속하는 새로 발견된 간염 바이러스이며, 전체적으로 C형 간염 바이러스와 높은 유사성을 가지고 있다. G형 간염 바이러스 NS3 단백질은 C형 간염 바이러스의 NS3 단백질과 마찬가지로 DEAD box family의 전형적인 amino acid 서열을 가지고 있으며 실제로 RNA-stimulated ATPase와 RNA helicase 활성을 가지고 있음을 증명하였다. 실제 기능에 있어서의 HGV NS3 단백질의 생화학적 성질과 HCV NS3 단백질과 다른 나선효소들과의 성질을 비교 분석하기 위해, 자세히 생화학적인 성질을 조사하였다. G형 간염 바이러스 NS3 단백질은 RNA/RNA duplexes를 3'' to 5'' 방향으로 풀고 RNA/DNA heteroduplexes와 DNA/DNA duplexes도 풀 수 있다는 사실이 증명되었다. 기질과의 결합특이성의 측면으로서는, G형 간염 바이러스 NS3단백질은 RNA/DNA, DNA duplexes와 결합하지만 blunted-ended RNA duplexes와는 잘 결합하지 못한다. G형 간염 바이러스 NS3 단백질의 RNA에의 결합 부위를 결정하는 실험에서는 Conserved motifs VI 부위가 RNA와의 결합에 중요한 역할을 하는 것이 밝혀졌으며, 이 부위의 amino acid sequence는 QRRGRTGRGRSGR이다. 또한 이러한 부위가 C형 간염 바이러스 NS3 단백질의 경우에도 RNA와의 결합에 중요한지를 실험해 봤을 때, G형 간염 바이러스와 마찬가지의 결론을 내릴 수 있었다. 이러한 결과들이 제시하는 바는 HCV NS3 단백질은 실지 기능면에서도 HCV NS3 단백질과 많은 유사성을 가지고 있었고, 그 작용 기작도 많은 유사성을 띠고 있음을 알 수 있었다. HCV NS3 단백질과 HGV NS3 단백질 모두 SV40 large T antigen 처럼 세포 내에서 전사 및 복제, 복구 등 다양한 조절기작에 관여할 가능성을 보여주는 것이다.
