The nar promoter of Escherichia coli, which is maximally induced under anaerobic conditions in the presence of nitrate, was characterized to investigate the feasibility of utilizing the nar promoter system for industrial-scale fermentation to produce recombinant proteins. To find the most suitable system, several different combinations of the nar promoters (the wild type nar promoter (pMW61) and the modified nar promoter (pMW618)) and E. coli strain (nar operon mutant (RK5265) and narL mutant (RK5278, $W3110narL^-$) were studied. For both pMW61 and pMW618, the nar promoters were cloned onto pBR322, and the lacZ gene expressing β-galactosidase instead of the structural genes of the nar operon was cloned for reporter gene downstream of the nar promoter. The modified nar promoter (pMW618) was prepared by changing several bases on the -10 and -35 region of the nar promoter, making the modified nar promoter insensitive to nitrate. The nar operation mutant (RK5265) cannot produce nitrate reductase by insertional mutation of transposon into narG gene, one of the structural genes of the nar operon. The narL mutants cannot produce narL, one of the activator proteins binding to the nar promoter once activated by nitrate. Here combinations of pMW61/RK5265 and pMW618/narL mutants will be described in more details as they have more desirable characteristics.
From the studies using the pMW61/RK5265 system, it was found that the best growth medium for the fed-batch culture was modified R medium, and it was necessary to keep the glucose concentration as low as possible during fed-batch operation to maximize induction of the nar promoter. The continuous low DO (Dissolved Oxygen) level used to induce the nar promoter enhanced formation of acetic acid, resulting in the inhibition of cell growth. To reduce the production of acetic acid during the induction period, alternating microaerobic and aerobic conditions achieved by exponential feeding with pH-stat mode of cultivation was employed. Using this strategy, acetic acid concentration was kept low even with fed-batch culture. Subsequently, the optimal culture conditions were found when cells were grown under aerobic conditions (DO>80%) in the presence of nitrate to $OD_{600}=35, and then the nar promoter was induced by lowering the DO level to 1-2% with alternating microaerobic and aerobic conditions. Under these conditions, the highest specific β-galactosidase activity was 40,000 Miller units at $OD_{600}$=130, equivalent to approximately 35% of the total cellular proteins. The specific β-galactosidase activity before induction was approximately 1,000 Miller units, giving an induction ratio of approximately 40.
As an attempt to get higher expression level, the wild type nar promoter (pMW61) including lacZ gene was transferred to a high copy number plasmid, pUC18, to make pLS61. In batch culture, the maximum specific β-galactosidase activity increased when a high copy number plasmid was used. In fed-batch culture, however, the specific activity decreased because of the instability of high copy number plasmid, pLS61. Cells lost the plasmids even more quickly when the DO level was lowered to induce the nar promoter.
Although pMW61/RK5265 system has promising properties to be used as a new inducible promoter, it has one disadvantage : nitrate should be added. Use of nitrate not only increases cost of induction but also can cause environmental damage. One modified nar promoter (pMW618), whose expression is known to be independent of nitrate, was tested indifferent E. One combination, pMW618/$W3110narL^-$, had excellent properties to be used as an inducible promoter. Optimal culture conditions were found when cells were grown under aerobic conditions in the absence of nitrate to $OD_{600}$=35 and then the modified nar promoter was induced by lowering DO level to 1-2% with alternating microaerebic and aerobic conditions. The maximum specific β-galactosidase activity became 58,000 Miller units at $OD_{600}$=160, equivalent to approximately 45% of total cellular proteins. In this case, the specific β-galactosidase activity just before induction was 3,200 Miller units, resulting in the induction ratio of 18.
Based on these results, it was concluded that the nar promoter can be used as a new inducible promoter with convenient induction properties and high expression level under the conditions of industrial-scale fermentation.
산소 의존형 nar 프로모터를 이용한 재조합 단백질이 대량 생산 가능성 여부를 알아보기 위하여, 유가식 배양에서 다양한 nar 프로모터 계에 대한 특성 연구가 수행되었다. 호기조건으로부터 혐기 조건으로 되었을 때 대장균이 만들어내는 효소 중에 질산염환원효소(nitrate reductase)가 있는데 nar 프로모터는 이의 발현에 관여하여, 배양액에 질산염($NO_3^-$)이 존재하는 조건에서 산소농도가 낮을 때 질산염환원효소를 최대로 발현시키게 한다. 본 연구에서는 질산염 환원효소를 발현하는 유전자 대신에 β-galactosidase를 발현하는 lacZ 유전자를 삽입하여 nar 프로모터에 의한 유도 발현 특성을 쉽게 조사할 수 있도록 제작된 재조합 대장균을 사용하였다.
우선 가장 좋은 결과를 보이는 것으로 보고된 pMW61/RK5265계에 대한 유가식 배양에서 최적의 유도발견조건을 구했다. 유가식 배양에 앞서 수행된 플라스크 및 회분식 배양의 결과로부터 modified R 배지가 유가식 배양의 배지로 선택되었고, 탄소원으로 공급되는 포도당의 농도는 최대한 낮게 유지시키는 것이 nar 프로모터의 유리하다는 결론을 얻었다. 포도당의 농도를 낮게 유지시키기 위한 전략으로 exponential feeding에 의해 배양액을 공급하면서 Ph보다 높을 때만 배양액을 공급하는 방법을 이용하였다. 초기단계의 연구에서, nar 프로모터의 유도를 위한 1-2%의 낮은 산소농도에서의 배양은 약 37g/L의 아세트산을 생성하였고, 이로 인하여 세포의 성장 및 단백질 발현이 저해되는 결과를 초래하였다. 이를 해결하기 위하여 nar 프로모터의 유도 후에 산소농도를 1-2%로 계속 낮게 유지시키지 않고 호기조건을 번갈아 적용시키는 전략으로 유가식 배양하였다. 그 결과, 아세트산의 생성은 현격하게 줄었고, 세포의 성장 및 단백질 발현에 대한 저해 현상은 관찰되지 않았다.
pMW61/RK5265계의 유가식 배양에서 nar 프로모터의 유도에 대한 최적 조건은, 질산염이 존재하는 조건에서 대장균을 $OD_{600}$=35 정도까지 높은 호기조건(DO=80%)에서 배양하다가 산소농도를 낮추어 낮은 호기조건(DO=10-20%)과 혐기조건(DO=1-2%)을 번갈아 적용시키는 것이었다. 이와 같은 조건에서 단위 세포농도($OD_{600}$=1) 당 β-galactosidase의 최대 활성도는 40,000 Miller unit였고, 이때의 세포농도는 $OD_{600}$=130 이었다. 최대 발현양은 총단백질의 약 35%에 달했으며, 유도율(induction ratio)은 약 40 이었다. 유도 전, 후 산소농도의 영향을 조사한 결과 발현유도 전의 산소농도는 높게 유지시키는 것이, 그리고 유도 후의 산소농도는 아세트산의 생성을 억제하는 범위 내에서 최대한 낮게 유지시키는 것이 단백질 발현에 유리하다는 것을 알 수 있었다.
단위세포 당 플라즈미드의 양이 nar 프로모터의 유도에 의한 단백질 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 high copy number 플라즈미드인 pLS61을 가진 재조합 대장균 RK5265를 배양하여 pMW61/RK5265계의 결과와 비교하였다. 회분식 발효에서 pLS61의 경우 β-galactosidase의 발현이 pMW61보다 약 30% 정도 증가되었다. 그러나 유가식 배양의 경우 pLS61의 심각한 불안정성(instabillity) 때문에 플라즈미드를 가지고 있지 않은 세포 수가 증가하면서 발현은 pMW61에 미치지 못하였다. 특히 pLS61의 불안정성은 nar 프로모터의 유도를 위하여 산소농도를 낮추었을 때 더욱 심하게 나타났고, 이러한 현상은 pMW61에서는 관찰되지 않았다.
pMW61/RK5265계에서는 nar 프로모터의 최대 유도 발현에 질산염의 첨가가 필수적이었다. 그러나 질산염은 토양 및 수질을 오염시키고 청색증, 부영양화 등 인간과 자연에 크게 해로운 가능성을 가지기 때문에 값싼 물질이라 하더라도 첨가하지 않는 것이 유리하다. 질산염의 첨가 없이 산소농도의 조절만으로 최대로 발현되는 nar 프로모터계를 찾기 위하여 플라즈미드, 염색체상의 변이주, 균주의 종류 등 다양한 조합에 대해 그 특성을 조사한 결과 $pMW618/W3110narL^-$ 계에서 nar 프로모터의 유도를 위한 유가식 배양의 최적조건은 pMW61/RK5265계의 경우와 같았고, 최대 발현은 $OD_{600}$=160에서 약 58,000 Miller units였다. 이는 총단백질의 약 45%에 달하는 양이고, 유도율은 약 18이었다. $W3110narL^-$ 균주에서는 nar 오페론의 조절단백질의 하나인 NARL이 발현되기 때문에 질산염이 첨가되었을 경우 산소농도를 낮추면 질산염환원요소에 의하여 아질산염($NO_2^-$)이 생성되어 오히려 세포성장이 저해되었다.
본 연구에서 사용된 nar 프로모터는 재조합 단백질의 발현을 위한 제어 변수인 산소농도가 미생물 배양의 조절 변수 중의 하나이기 때문에 그 유도가 손쉽고 간단하며 경제적인 특징이 있으며 발현수준도 상당히 높기 때문에 산업화에 적합할 것으로 사료된다.
