In this study, the possibility of constructing a nonnatural metabolic pathway was evaluated by expression of the malic enzyme in a host which lost fermentation ability.
The sfcA gene (1.7 kb) encoding E. coli malic enzyme was cloned by PCR from E coli XL1-Blue.
Flask cultures were carried out in LB medium and induced with 0.01 mM IPTG. Higher IPTG concentration resulted in no production of succinic acid. E. coli strain NZN111 harboring pTrcML produced 8 g/L of succinic acid in flask culture. It is 6 times higher than that produced by wild type E. coli.
Fermentation studies were carried out at various temperatures and pH. When NZN111 cultured at 30℃ and pH 6.7, 9.5 g/L of succinic acid was produced.
Metabolic flux analysis showed that there exist a cyclic pathway among phosphoenolpyruvate carboxylase, pyruvate kinase, and malic enzyme. Overexpression of malic enzyme caused bottle neck, and reduced expression of malic enzyme somewhat resolved the bottleneck problem.
새로운 대사회로를 도입하여, 재조합 대장균에 의한 숙신산 생산을 시도하였다.
Malic enzyme을 coding하는 sfcA 유전자를 PCR방법에 의해서 얻었으며, 이 유전자를 포도당 대사능력을 상실한 돌연변이 균주 NZN111에 도입하였다.
플라스크 실험결과 8 g/L의 숙신산이 생산되었으며, 이것은 정상적인 대장균이 생산하는 양의 6배에 해당하는 것이다. 또한 발효기를 사용한 발효의 결과, 9.5 g/L의 숙신산이 생산되었으며 초산, 젖산 등의 생산은 억제되었다. 현재 가장 효율적인 숙신산 생산균주인 Anaerobiospirillum succiniciprodecens 이 숙신산과 함께 과량의 초산을 생산하므로 본 방법은 효율적인 숙신산 생산방법이라 할 수 있다.
실험결과에 대한 대사회로분석의 결과, 숙신산 생산의 중간산물인 말산의 과량생산으로 인한 bottleneck 현상이 발견되었다. 또한, Phosphoenolpyruvate carboxylase, pyruvate kinase, malic enzyme 간의 순환회로가 형성된다는 것이 밝혀졌다.
대사회로분석방법을 사용하여 개선방법을 찾아보았다. non-PTS 균주의 사용은 숙신산의 생산에 영향을 끼치지 못했으며, 말산과 젖산 생산량의 감소는 숙신산 생산량을 증가시키는 효과가 있다고 예측되었다.