Several strains capable of desulfurizing dibenzothiophene(DBT), which is representative of organic sulfur compounds in petroleum were isolated in this study. Among them, three strains named as Gordona sp. CYKS1, Nocardia sp. CYKS2 and Nocardia sp. CYKNII9 were found to be capable of desulfurizing DBT via sulfur-specific pathway, which is considered to be advantageous due to no loss of fuel value. The dead-end metabolites of DBT were found to be 2-hydroxybiphenyl(2-HBP) and sulfate. The strains Gordona sp. CYKS1 and Nocardia sp. CYKS2 showed an ability of desulfurizing about 15 other organic sulfur compounds than DBT encompassing thiols, sulfides, disulfides and thiophene derivatives. About 0.2 mM of DBT was entirely desulfurized in 60 hours and the cell concentration reached about 2.8 g/L in a batch fermentation using minimal salt medium(MSM) in which DBT dissolved in ethanol was added as a sole sulfur source(DBT.ethanol system). Almost equimolar amount of 2-HBP was produced. The two dead-end metabolites, 2-HBP and sulfate strongly inhibited the desulfurization activity of CYKS1 and CYKS2. No desulfurization occurred over 0.2 mM of 2-HBP. The strains CYKS1 and CYKS2 could utilize ethanol as well as glucose as a carbon source. The optimal range of pH for desulfurization and cell growth was 7.0 to 8.0. The desulfurization rate decreased about 30% when the initial pH was 6.0, and no significant desulfurization was observed when the initial pH was 5.0 Tween-80 was used for the investigation of surfactant effect on desulfurization activity. The addition of Tween-80 enhanced the cell growth rate and desulfurization rate in the initial stage in DBT/ethanol system by increasing the solubility of DBT. However, as desulfurization progressed, the effect became negligible because of some biosurfactants produced by the strains.
A model oil(DBT/hexadecane) system which 10 mM of DBT was dissolved in hexadecane, the major component of diesel oil, was used to simulate the desulfurization of actual oils. The model oil was treated with cell suspended in MSM. The strains Gordona sp. CYKS1 and Nocardia sp. CYKS2 were found to adhere to the oil phase to utilize sulfur compounds in it than secrete solubilizers. About 10 mM of DBT in hexadecane was desulfurized in 60 hours by Gordona sp. CYKS1. The volumetric desulfurization rate was 0.255 mg-sulfur/L-dispersion/h. The desulfurization rate increased as the initial DBT concentration in hexadecane increased. However, there was little change in the desulfurization rate as the ratio of oil to aqueous phase changed.
In the case of real unhydrotreated diesel oils treatment, two types of diesel oils with different sulfur contents were used. When the phase ratio was 1/20, light gas oil(LGO) which had a relatively low sulfur content(0.3 wt%) was desulfurized to 0.187 wt% in 48 hours by Gordona sp. CYKS1. However, no further decrease of sulfur content was observed after 48 hours. Middle distillate unit feed(MDUF) which had a high sulfur content (1.0 wt%) was desulfurized to 0.856 wt% in 48 hours by Gordona sp. CYKS1. The desulfurization rates were 1.121 and 1.429 mg-sulfur/ L-dispersion/h for LGO and MDUF, respectively. The desulfurization rate increased as initial sulfur content increased and slightly decreased as the phase ratio increased. These results are similar to those of model oil treatment.
Desulfurization was carried out by using resting cells and immobilized cells. The desulfurization activity of resting cells of CYKS1 was observed to be strongly depended on harvest time. The specific desulfurization rate in treating DBT/hexadecane by the cells harvested at an early growth phase(at 24 hours) was 0.117 mg-sulfur/g-cells/h. The specific desulfurization rates were 0.082 and 0.035 mg-sulfur/g-cells/h when the cells harvested at 48 and 72 hours, respectively. The specific desulfurization rate of resting cells decreased as reaction progressed. It was 0.159 (mg-sulfur/g-cell/h) during the initial 3 hours, but it decreased to 0.036 (mg-sulfur/g-cell/h) later. Accumulation of inhibitory metabolites, such as 2-HBP and sulfates and deficiency of reducing power due to glucose depletion were speculated to cause the decrease in the specific desulfurization rate. In the case of LGO treatment, the sulfur content decreased from 0.3 to about 0.195 wt% in 10 hours. The specific desulfurization rate was 0.340 mg-sulfur/g-cell/h for the initial 10 hours. However, no significant desulfurization was observed after 10 hours. When diluted MDUF(0.15 wt% sulfur) was treated, its sulfur content decreased to 0.06 wt% in 10 hours.
Because the desulfurization activities of the strains Gordona sp. CYKS1 and Nocardia sp. CYKS2 were known to be inhibited by 2-HBP and sulfates, two-stage fermentation strategy in which cell growth and desulfurization activity induction were separated was developed for the potential use in the mass production of cells. Sodium sulfate was used as a sole sulfur source in the cell growth stage and DBT was used as a sole sulfur source in the desulfurization activity induction stage. The cell concentration of CYKS1 reached 9.38 g/L in 54 hours in the first stage. The desulfurization activity of resting cells was turned on by 12 hours of induction. The specific desulfurization rate was somewhat lower but biocatalysts productivity was higher than that obtained when the cells were grown in the presence of DBT.
Desulfurization using immobilized cells was also carried out. Celite bead was used for immobilization. The treatment was done in a repeated batch mode. Each batch reaction was carried out for 24 hours. In the case of using Gordona sp. CYKS1, about 4.0 mM of DBT in hexadecane was desulfurized during the first batch, but 7.8 mM during the final 8th batch. This results was considered to be caused by increase of cell loading in celite beads. LGO was desulfurized from 0.3 to 0.211 wt% during the first batch without further increase in desulfurization rate in the subsequent batches. The immobilized cells maintained about 50 to 70% of its initial desulfurization activities when stored at 4℃ for 10 days in 0.1 M phosphate buffer(pH 7.0).
석유내 유기황인 대표물질인 DBT(dibenzothiophene)에 대한 탈황능을 지닌 수종의 균주를 염색폐수로부터 분리하였다. 그 중에서 CYKS1과 CYKS2라고 명명된 Gordona sp. 와 Nocardia sp.균주가 탄소-황간의 결합에 특이성을 갖는 경로로 DBT를 탈황하는 것으로 밝혀졌다. 최종적인 DBT의 대사산물은 2-hydroxy-biphenyl(2-HBP)과 sulfate였다. DBT외의 유기황 화합물에 대한 탈황능을 조사한 결과, Gordona sp. CYKS1과 Nocardia sp. CYKS2 모두가 thiols, sulfides, disulfides 및 thiophene 유도체 등의 유기황 화합물에 대한 탈황능을 지니고 있는 것으로 확인되었다. CYKS1의 회분식 배양결과, 0.2 mM의 DBT가 약 60 시간만에 모두 분해되었으며, 동일 몰수의 2-HBP가 생성되었다. 하지만 2-HBP의 휘발성 때문에, 완전히 밀폐된 시스템이 아니면 정확한 2-HBP의 생성량 측정이 어렵다. DBT/에탄올 시스템에서 분리된 탈황균주의 생리학적 특성에 관한 연구를 수행하였다. CYKS1과 CYKS2 모두 에탄올을 탄소원으로 사용하였으며, 대사산물인 2-HBP와 sulfate에 의해 탈황능이 저해받는 것으로 나타났다. 최적 pH는 7.0 ~ 8.0이었으며, pH 6.0정도에서는 약 70%의 정도로 탈황속도가 느려졌다. 하지만 pH가 5.0 이하이면 거의 탈황이 이루어지지 않았다. 비교적 세포 성장에 대한 저해가 없는 것으로 알려진 계면활성제인 Tween-80을 첨가한 결과, 초기에는 탈황속도가 증가하였으나, 시간이 갈수록 계면활성제를 첨가하지 않은 것과 별다른 차이를 보이지 않았다. 이는 배양이 진행됨에 따라 균주가 생리계면활성제를 분비하기 때문인 것으로 사료된다.
디젤유의 주성분인 hexadecane에 10 mM의 DBT를 녹인 모델유를 사용하여 유상과 수상의 이상계에서의 탈황특성에 관한 연구를 수행하였다. 이 경우 탈황속도 및 균주 성장속도가 에탄올에 녹인 DBT를 사용한 경우보다 높게 나타났다. 이는 물에 난용성인 유기황 화합물을 이용하는 균주의 특성에 따른 것으로 사료된다. 즉, 분리된 CYKS1과 CYKS2는 세포표면의 소수성(hydrophobicity)을 증가시켜, 유상에 부착되어 유상내 유기황 화합물을 이용하는 것으로 나타났다. 약 60 시간만에 hexadecane내에 포함된 10 mM의 DBT가 모두 탈황되었으며, 이때 탈황속도는 약 0.255 mg-sulfur/L-dispersion/h였다. 탈황속도는 hexadecane내에 포함된 DBT의 초기 농도가 증가함에 따라 높아졌으며, 유상과 수상간의 상비(phase ratio)?〈ⓟ 그다지 큰 영향을 받지 않았다. 화학적 탈황공정을 거치지 않은 황함량 0.3 wt%의 LGO(light gas oil)와 1.0 wt%의 MDUF (middle distillate unit feed)를 처리한 결과 48 시간만에 LGO의 경우 약 0.113 wt%, MDUF의 경우 약 0.144 wt%가 탈황되었다. 이때 탈황속도는 각각 1.121, 그리고 1.429 mg-sulfur/L-dispersion/h였다. 이로부터 낮은 농도의 유류뿐 만 아니라, 고농도의 유류에 대해서도 생물학적인 탈황이 가능함이 확인되었다. 실제 디젤유의 처리에서도 모델유의 처리에서와 같이 초기 황농도가 높아짐에 따라 탈황속도가 증가하고, 상비가 증감함에 따라 탈황속도가 감소하는 비슷한 경향이 관찰되었다.
휴식세포(resting cells)를 사용한 탈황에 관한 연구도 수행되었다. 휴식세포는 세포성장은 거의 없으나, 효소 활성등 몇몇 생리학적 특성은 유지하고 있는 상태를 말한다. 이 연구에서는 사용된 배지에 따라 휴식세포와 성장세포(growing cells)를 구분하였다. 휴식세포의 탈황능은 회수된 시간과 밀접한 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 초기 대수성장기인 24 시간만에 회수된 휴식세포는 약 0.117 mg-sulfur/g-cell/h의 비탈황속도(specific desulfurization rate)를 가졌으나, 48, 72시간에 회수된 휴식세포는 각각 0.082 와 0.035 mg-sulfur/g-cell/h의 비탈황속도를 나타내었다. 하지만 단위시간당 생산되는 생촉매의 양으로 정의되는 생촉매의 생산성을 고려한다면 48 시간정도에 세포를 회수하여 휴식세포를 제조하는 것이 가장 최적인 것으로 사료된다. 휴식세포를 이용한 모델 DBT/hexadecane의 탈황에서 비탈황속도는 초기 3 시간까지는 약 0.159 mg-sulfur/g-cell/h였으나 최종적으로 약 15 시간만에 0.036 mg-sulfur/g-cell/h로 감소하였다. 이는 수용액상에 농축되는 대사산물에 의한 저해효과 및 탈황에 관련된 환원력이 고갈되기 때문인 것으로 사료된다. 휴식세포를 이용한 실제 디젤유의 탈황에서는 약 10 시간만에 약 0.105 wt%의 탈황에 일어난 후 더 이상 탈황이 진행되지 않는 것으로 나타났다. 이때 탈황속도는 약 0.340 mg-sulfur/g-cell/h였다. 비교적 낮은 0.15wt% 의 MDUF를 처리한 결과 10 시만에 0.06 wt%까지 탈황되어 고심도 탈황이 가능함도 확인하였다. CYKS1과 CYKS2의 탈황능 및 성장이 2-HBP 및 sulfate에 의해 저해를 받기 때문에 세포의 성장기와 탈황능이 유도기를 분리하는 2 단계 발효기법을 사용한 생촉매의 대량생산기법에 대한 연구를 수행하였다. 비교적 짧은 지연기(lag time)를 지난 후 곧 탈황능이 회복되었다. 세포 농도는 Na2SO4를 황원으로 사용한 첫 번째 단계에서 약 9.38 g/L까지 도달하였다. DBT를 유일 황원으로 사용한 2 번째 단계에서 약 12 시간의 유도기를 거친 후 제조된 휴식세포는 DBT를 유일 황원으로 하여 성장시킨 후 회수한 휴식세포에 비해 약간 낮은 비탈황속도를 나타내었다. 세포의 고정화를 위해서 celite 담체가 사용되었다. 전체적으로 반복적 회분반응(repeated batch reaction)의 형태를 가지고 있으며, 각각의 회분반응은 24 시간동안 진행되었다. CYKS1을 사용한 경우, 첫 번째 회분반응에서는 약 4.0 mM의 DBT만이 탈황된 데 비해, 마지막 8번째 회분반응에서는 약 7.8 mM의 DBT가 탈황되었다. LGO을 처리한 경우에는 첫 번째 반응에서 약 0.089wt%가 탈황되었으나, 반응이 진행됨에 따라 탈황속도가 증가하지는 않는 것으로 나타났다. 고정화된 생촉매는 0.1 M의 인산염 완충용액을 사용하여 4 ℃에서 보관하면 약 50 %에서 70%의 활성이 유지되었다.
